JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 2:59 dk • July 8th, 2025
Tanımlanmış bir üçüncül yapıya sahip olmayan nükleer yanlış katlanmış proteinler, ubikitin-proteazom sistemi olan UPS dahil olmak üzere proteolitik sistem tarafından bozunmalarını kolaylaştıran küçük ubikuitin benzeri değiştiriciler, SUMO'lar ve ubikuitin molekülleri ile etiketlenir.
Bazı nörodejeneratif hastalıklarda, UPS disfonksiyonu, nükleer yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine ve toplanmasına neden olarak nöronal ölüme yol açar.
Nükleer yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranını in vitro olarak araştırmak için, yapışık memeli hücrelerinin bir kültürünü, floresan etiketli yanlış katlanmış protein kodlayan plazmit DNA'sı ve bir transfeksiyon reaktifi içeren bir karışımla tedavi edin.
Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, bir nükleer lokalizasyon sinyali ile etiketlenmiş floresan etiketli, kısa yarı ömürlü yanlış katlanmış proteinleri eksprese eder. Çekirdeğe taşındıktan sonra, bu yanlış katlanmış proteinler SUMOylation ve ubikitinasyona uğrar ve protein bozunması ve temizlenmesi için UPS'e aktarılır.
İnkübasyon sonrası, ortamı sikloheksimid içeren düşük floresan bir ortamla değiştirin. Hücre geçirgen bir molekül olan sikloheksimid, büyük ribozomal birime bağlanır ve protein translasyonunun uzama fazını ve daha fazla protein sentezini bloke ederek, floresan etiketli çevrilmiş yanlış katlanmış proteinlerin bozunma hızının incelenmesini kolaylaştırır.
Proteazom aktivitesini bloke etmek ve yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine neden olmak için bir dizi kuyucuğu bir proteazom inhibitörü ile muamele edin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, yanlış katlanmış proteinlerin floresansını ölçün.
Floresansta zamana bağlı bir düşüş, yanlış katlanmış protein bozulmasını gösterir. Proteazom inhibitörü ile muamele edilen hücreler, zaman içinde benzer floresan yoğunluğu sergiler ve bu da yanlış katlanmış protein bozulmasının inhibisyonunu gösterir.
Metin protokolüne göre 96 oyuklu plakalarda HeLa hücrelerini tohumladıktan ve transfekte ettikten sonra; Transfeksiyondan 20 ila 24 saat sonra, hücreleri GFP ekspresyonu açısından inceleyin. Ortamı her bir oyuğa yaklaşık 200 mikrolitre 1x PBS'de çıkarın ve ardından kalan DMEM'i çıkarmak için aspire edin.
% 5 FBS ile 60 mikrolitre düşük floresan DMEM ve mililitre sikloheksimid başına 50 mikrogram ekleyin ve bir numune setine 10 mikromolar MG132 ekleyin.
Bir floresan plaka okuyucu ile, plakaları okuyan GFP sinyalini her saat 8 ila 10 saate kadar ölçün. Verileri dışa aktarın ve metin protokolüne göre istatistiksel analiz yapın.