JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 2:36 dk. • July 8th, 2025
Lusiferaz, biyolüminesans bir ürün oluşturmak için substratını oksitleyen bir enzimdir.
Lusiferazın bu özelliği, enzimin bölünmüş versiyonunun kullanıldığı nanolusiferaz bazlı bir raportör sistemin tasarlanması için yararlıdır. Bu sistemde, daha küçük ve daha büyük parçalar birbirlerine karşı yüksek bir bağlanma afinitesine sahiptir ve fonksiyonel enzimi yeniden oluşturabilir.
SARS-CoV-2 spike glikoproteininin reseptör bağlanma alanı olan hedef proteini tespit etmek için nanolusiferaz bazlı sistemi kullanmak için, yapışık hücreler içeren bir kültür kabı ile başlayın. Bu hücreler, tasarlanmış nanolusiferazın daha küçük fragmanı için spesifik bir diziyle bağlantılı olarak hedef proteini kodlayan bir plazmit içerir.
İfade üzerine, kültürlenmiş hücreler biyomuhabirler üretir - lusiferazın daha küçük fragmanı ile kaynaşmış rekombinant hedef proteinler. Hücreleri bir lizis tamponu ile tedavi edin ve çalkalama altında inkübe edin. Tampon bileşenleri hücreleri hızla parçalayarak biyo-muhabirler de dahil olmak üzere hücresel içeriği süpernatan içine bırakır.
Süpernatanı çok kuyulu bir tahlil plakasına aktarın. Her bir kuyucuğu, bölünmüş nanolusiferazın büyük parçalarını içeren çözelti ile destekleyin ve inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, büyük fragman kendiliğinden biyomuhabirin küçük alt birimi ile bağlanır ve fonksiyonel bir konformasyon elde eder. Furimazin içeren bir çözelti - substrat ekleyin ve tahlil plakasını bir luminometreye yerleştirin.
Fonksiyonel enzim, parlak bir ışıldayan sinyali yayarak furimazini oksitler. Sinyalin büyüklüğü, hedef protein konsantrasyonu ile ilişkilidir.
Bir lusiferaz tahlili kullanarak biyoreporterden gelen ışıldayan sinyali değerlendirmek için, önce reaksiyon bileşenlerini hazırlayın ve süpernatanı biyoreporterin kaynağı olarak kullanın.
Kullanmadan önce LgBiT'yi ve alt tabakayı 1x'e kadar seyreltin. Her bir kuyucuktan veya tüpten 50 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve her oyuğa 50 mikrolitre 1x LgBiT ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
Luminometre yazılımını açın. Her kuyucuğa 50 mikrolitre 1x substrat ekleyin. Plakayı luminometreye yerleştirin ve yazılımı çalıştırın.