JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:11 dk. • July 8th, 2025
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 veya SARS-CoV-2 enfeksiyonu sırasında, virüs spike proteininin reseptör bağlanma alanı (RBD), konak hücre anjiyotensin dönüştürücü enzim 2, ACE2'ye bağlanarak viral hücre girişini kolaylaştırır. Buna karşılık, bağışıklık sistemi viral RBD'ye bağlanan ve hücresel girişi önleyen antikorlar üreterek viral enfektiviteyi azaltır.
RBD hedefli SARS-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için, SARS-CoV-2 spike RBD'ye kaynaşmış küçük boyutlu protein parçalarından oluşan rekombinant bir biyomuhabir süspansiyonu alın. Standart RBD hedefli SARS-CoV-2 antikorları ve antikor bağlayıcı manyetik boncuklar ekleyin.
İnkübasyon sırasında, Fc antikor bölgesi, boncukların Fc bağlama alanlarına bağlanır. Ek olarak, rekombinant biyomuhabir, boncuk bağlı RBD hedefli SARS-CoV-2 antikorlarına bağlanır.
Kuluçka sonrası karışımı santrifüjleyin. Bağlanmamış biyomuhabir içeren süpernatanı çıkarın. Bağlı boncukları arabellekte yeniden askıya alın. Çok kuyulu bir plakaya aktarın.
Küçük boyutlu protein parçaları için yüksek afiniteye sahip, büyük boyutlu protein parçaları içeren bir çözelti ekleyin. Büyük ve küçük boyutlu protein parçaları birbirine bağlanarak aktif bir mühendislik lusiferaz enzimi oluşturur.
Bir lusiferaz substratı olan furimazin ekleyin. Lusiferaz, furimazinin oksidasyonunu katalize ederek ışık emisyonuna neden olur. Bir luminometre kullanarak, nötralize edici antikorların varlığının göstergesi olan lüminesansı ölçün.
Yüksek sinyal yoğunlukları, yüksek konsantrasyonlarda RBD hedefli SARS-CoV-2 antikorlarını düşündürür.
HiBiT-RBD antikor tespit testini gerçekleştirmek için, HiBiT-RBD biyomuhabirini hazırlayın ve 50 mikrolitre HiBiT-RBD içeren süpernatanı 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte 1 mikrogram ticari SARS-CoV-2-RBD antikoru ile birleştirin.
Çözeltiye 20 mikrolitre immünoglobulin bağlayıcı protein veya protein G ekleyin. PBS ekleyerek toplam hacmi 300 mikrolitreye getirin. Tüpleri bir tüp çalkalayıcı veya döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin, 12.000 x g'da 30 saniye santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın ve PBS ile yıkayın. Serbest HiBiT-RBD'yi çıkarmak için işlemi üç kez tekrarlayın.
Hücreleri 50 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 50 mikrolitre 1x LgBiT ekleyin ve 5 dakika bekleyin. Ardından, 50 mikrolitre 1x NanoLuc substrat ekleyin. Lüminesans sinyalini hemen bir luminometre ile okuyun.