İn Vitro Persister Testi: Osmolitlerin Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 4:54 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zararlı ortam koşullarına maruz kaldığında, bir bakteri alt kümesi, zararlı etkilerden kaçınarak düşük metabolik aktivite durumuna girer. Kalıcı olarak adlandırılan bu bakteriler, yüksek konsantrasyonlarda antibiyotiklere geçici maruz kalmayı tolere edebilir.

Ozmolitlerin - küçük organik çözünen maddeler - bakteri kalıcılığı üzerindeki etkisini incelemek için, önce, ortamda asılı tutulan, tespit sınırının altında önceden var olan kalıcılarla üstel fazlı bir bakteri hücre kültürü elde edin.

Daha sonra, süspansiyonu bir mikrodizi plakanın ozmolit içeren kuyucuklarına aktarın. Kontrol olarak ozmolit içermeyen bir dizi kuyu tutun. Hücre büyümesi ve inkübe edilmesi için hızlı gaz difüzyonuna izin vermek için plakayı gaz geçirgen bir zarla kapatın.

Uygun konsantrasyonlarda ortamdaki ozmolitler ozmotik stresi indükleyerek bazı hücrelerin hücresel metabolizmalarını hızlıdan yavaş büyümeye doğru yeniden programlamalarını tetikleyerek kalıcılar oluşturur.

Şimdi, ozmolit ile muamele edilmiş ve kontrol hücrelerini antibiyotik içeren kalıcı bir tahlil plakasına aktarın. Kalıcı tahlil plakasını kapatın ve inkübe edin.

Antibiyotiklerin varlığında, normal hücreler hücre ölümüne uğrarken, antibiyotiğe toleranslı olan ısrarcılar hayatta kalır. Son olarak, hücrelerin küçük bir kısmını toplayın, tamponla seri olarak seyreltin ve antibiyotik içermeyen bir agar plakasına yerleştirin. Plakayı inkübe edin.

Antibiyotiklerin yokluğunda, kalıcılar büyümeye devam eder ve çoğalarak koloniler oluşturur. Agar plakasındaki koloni sayısını sayın.

Antibiyotik tedavisi sonrası ozmolit kontrolü olmayan koloni sayısından daha fazla sayıda koloni, ozmolitlerin kalıcı oluşumu üzerinde olumlu bir etkisi olduğunu düşündürmektedir.

Mikrodizi hücre kültürleri hazırlayarak başlayın.

250 mikrolitre üstel faz hücresini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Ardından, homojen hale getirmek için hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın.

Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu steril 50 mililitrelik bir rezervuara aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 150 mikrolitre hücre süspansiyonunu, çeşitli kimyasallar içeren bir mikrodizi plakasının her bir oyuğuna aktarın. Mikrodiziler, metin el yazmasında açıklanan yöntem izlenerek manuel olarak da oluşturulabilir.

Mikrodizi plakasını gaz geçirgen bir sızdırmazlık membranı ile örtün ve 37 santigrat derecede ve 24 saat boyunca 250 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.

Kalıcı tahlil plakaları yapmak için, 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde mililitre başına 5 mikrogram Ofloksasin içeren 25 mililitre modifiye LB ortamı hazırlayın ve bu ortamı steril bir rezervuara aktarın.

Modifiye edilmiş LB ortamının 190 mikrolitresini genel bir düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna aktarın. 24 saatlik inkübasyondan sonra, mikrodiziyi çalkalayıcıdan çıkarın ve mikrodiziden 10 mikrolitre hücre kültürünü, Ofloksasin ile modifiye edilmiş LB ortamı içeren Persister tahlil plakasının kuyucuklarına aktarın.

Persister tahlil plakasından 10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plaka ve çok kanallı bir pipet kullanarak 290 mikrolitre PBS çözeltisinde 3 kez seri olarak seyreltin. Ardından, antibiyotik içermeyen taze agar plakaları üzerinde seri olarak seyreltilmiş tüm hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini tespit edin.

Persister tahlil plakasını gaz geçirgen bir sızdırmazlık membranı ile örtün ve 37 santigrat derecede ve altı saat boyunca 250 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.

6 saatlik inkübasyondan sonra, agar plakaları üzerinde seri seyreltme ve lekelenmeyi tekrarlayın. Agar plakalarını 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin, ardından koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları sayın. Her bir oyuktaki Persister fraksiyonunu hesaplamak için antibiyotik tedavisinden önce ve altı saat sonra CFU seviyelerini kullanın.

OFX tedavisinden önce CFU sayımları, ozmolitlerin E. coli canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmeye de yardımcı olur.

09:09

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:57

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem Mycobacterium tuberculosis

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:29

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir Mycobacterium tuberculosis

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:02

Bakterilerde Antibiyotik Kalıcılığını İncelemek için Mikroakışkan Hızlandırılmış Mikroskopi

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:57

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:37

Bakteri Kaynaklı Antimikrobiyal Bileşiklerin Etkisini Değerlendirmek için Ertelenmiş Bir Büyüme İnhibisyonu Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:20

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi In Vitro Yapışma Deneyi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:47

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:42

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:38

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026