JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:03 dk • July 8th, 2025
Hücresel protein homeostazı veya proteostaz, yanlış katlanmış proteinlerin bozulması ile birlikte protein katlanmasının ve fonksiyonunun düzenlenmesini içerir. Yaşlanma sırasında, proteostaz mekanizması azalır, yanlış katlanmış proteinlerin birikmesine ve daha fazla toplanmasına neden olarak hücresel işlev bozukluğuna neden olur.
Yaşa bağlı proteostaz düşüşünü belirlemek için, gelişimsel olarak senkronize, yetişkin transgenik Caenorhabditis elegans ile başlayın.
Bu solucanların kas hücreleri, bir floresan etiketi ile kaynaşmış anormal şekilde genişlemiş poliglutamin veya poliQ tekrarları ile proteinleri eksprese eder. PolyQ proteinleri yanlış katlanmaya eğilimlidir ve bu nedenle birikme üzerine agregalar oluşturabilir.
Solucanları bir agaroz pedi içeren bir mikroskop lamına aktarın ve canlı hücre görüntüleme için uygun kimyasalla hareketsiz hale getirin. Bir floresan mikroskobu kullanarak, floresan polyQ agregalarına karşılık gelen parlak, floresan odak sinyallerini belirlemek için solucanların vücut duvarı kaslarını belirli bir süre boyunca görselleştirin.
Yaşa bağlı proteostazın azalmasına bağlı olarak günler içinde ilerleyici poliQ agregat birikimi meydana gelir ve bu da daha fazla sayıda floresan odağına yol açar. Kas hücrelerinde artan poliQ agregatları toksisiteye neden olur ve kas hücresi fonksiyonunu bozarak felce neden olur.
Mikroskop altında, mekanik uyaranlara göre hareket etmeyen canlı, felçli solucanların sayısını kaydedin. Artan solucan felci oranı, solucanlardaki kas dokusunda yaşa bağlı proteostaz düşüşünü gösterir.
Kas dokusundaki proteostazdaki düşüşü ölçmek için 20 hayvan seçin ve bunları% 3 agaroz ped ve 5 mikrolitrelik 10 milimolar sodyum azid damlası ile bir mikroskop lamına monte edin.
Tüm solucanlar hareketsiz hale getirildikten sonra, 10x büyütme lensi kullanarak hayvanların tüm vücutlarını görüntüleyin. Her hayvan için bir FITC veya YFP filtresi ve aynı pozlamayı kullanın. İşiniz bittiğinde slaytları atın.
Tüm hayvanın vücut duvarı kaslarındaki odak sayısını sayın. Odaklar, arka plandaki daha kısık çözünür sinyalden ayırt edilebilen daha parlak, noktalanmış sinyallerdir.
Puanlama günlerinde, hayvanların bulunduğu plakalara bakın ve felçli hayvanların sayısını kaydedin. Ardından, felçli hayvanları plakadan çıkarın.
Deneyin tamamlanmasının ardından, her koşul için felç oranını hesaplayın ve felç ilerlemesini çizin.