Amplifiye Lüminesan Yakınlık Homojen Deneyi: Protein-Protein Etkileşimlerini İnhibe Eden Küçük Molekülleri Taramak için Boncuk Tabanlı Bir Yakınlık Testi

Biyolojik sistemlerde, bir proteinin spesifik ortağına yakınlığı, başarılı protein-protein etkileşiminin çok önemli bir belirleyicisidir. Küçük inhibitör moleküller mevcut olduğunda, bu proteinler birbirlerine yaklaşamazlar ve etkileşimlerini bozarlar.

İki protein arasındaki etkileşimleri bozmak için inhibitör molekülleri taramak için - bir şaperon ve ko-şaperon - çeşitli küçük moleküller içeren çok kuyulu bir plaka alın. Kuyucukları, yüzeylerine yardımcı refakatçiler takılmış donör boncuklarla destekleyin. Bu boncuklar, kemilüminesans testi için ışığa duyarlılaştırıcılar içerir.

Özellikle ko-şaperona bağlanan şaperondan türetilmiş peptit dizilerine konjuge edilmiş bir alıcı boncuk bulamacı ekleyin. Boncuklar, görselleştirme için gerekli olan tioksen bazlı bir boya ve floroforlar içerir.

İnhibitör olmayan moleküllere sahip kuyucuklarda, şaperon bağlayıcı peptitler ve ko-şaperonlar arasındaki yüksek afiniteler, alıcı ve verici boncukları çeker. İnhibitörler mevcut olduğunda boncuklar uzak kalırken.

Bir kemilüminesans okuyucu kullanarak etkileşimi inceleyin. Belirli bir dalga boyunda aydınlatma üzerine, donör boncuk ışığa duyarlılaştırıcılar oldukça reaktif singlet oksijenler yayar.

İnhibitör moleküller olmadan, yayılan türler proksimal olarak yerleştirilmiş alıcı boncukların yakınına ulaşır ve boya molekülleri ile reaksiyona girerek kemilüminesansa neden olur. Bu enerji, alıcı boncukların floroforlarını aktive ederek ışık emisyonuna neden olur.

Buna karşılık, inhibitör moleküllere sahip kuyucuklarda, singlet oksijenler bozunmaya uğrar ve bu da protein-protein etkileşimlerinin başarılı bir şekilde inhibisyonunu gösteren ışık emisyonunun yokluğuna yol açar.

PBS'de mililitre konsantrasyonda 10 mikrogram glutatyon donör boncukları ekleyin. GST-FKBP51'i mililitre başına 10 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve reaksiyonu karanlıkta 25 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

DMSO'da test bileşiğinin seri seyreltmelerini yapın. 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun köşesine üç nüsha halinde 0.25 mikrolitre test bileşiği seyreltmesi ekleyin.

Negatif kontrol için 0.25 mikrolitre DMSO ekleyin ve pozitif kontrol için kuyucuklara 0.25 mikrolitre Hsp90 C-terminal peptid ekleyin.

Her oyuğa GST etiketli proteinler içeren glutatyon donör boncukları içeren çözeltiden 22.5 mikrolitre ekleyin. Plakayı elinizle iyice çalkalayın ve karanlıkta 25 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Alıcı boncukları ekli Hsp90 C-terminal peptidi ile 0.5x PBS'de mililitre başına 100 mikrograma seyreltin. Her oyuğa 2.25 mikrolitre seyreltilmiş alıcı boncuk ekleyin. Plakayı gösterildiği gibi karanlıkta 15 dakika çalkalayın ve inkübe edin.

Plaka okuyucu cihazını açın, plakanın sinyalini ölçün ve verileri metin el yazmasında açıklandığı gibi analiz edin.