JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:43 dk • July 8th, 2025
Başlamak için, zarflı bulaşıcı bir virüs olan herpes simpleks virüsünün seri dilüsyonlarını tamponda hazırlayın.
Tek katmanlı virüse duyarlı epitel hücre kültürü içeren çok kuyulu bir plaka elde edin. Belirli hacimdeki besiyerini seyreltilmiş viral süspansiyonlarla değiştirerek tek katmanlı kapsama alanı sağlayın. Virüsün hücre yüzeyine adsorbe olmasına izin verin.
Adsorbe edilmemiş virüsleri kaldırın. Hücre tek tabakasını metilselüloz içeren ortamla kaplayın ve yarı katı bir kaplama oluşturun.
İnkübasyon üzerine, viral zarf ve hücre zarı birleşir ve çift sarmallı genomu çevreleyen viral nükleokapsidi sitoplazmaya bırakır. Ayrıca, viral genom hücre çekirdeğine salınır.
Viral genom, konakçının hücresel mekanizmasını ve virion proteinini kullanarak, erken genlerin ekspresyonunu düzenleyen hemen erken viral proteinleri eksprese eder. Erken viral proteinler, viral DNA replikasyonuna aracılık eder.
Daha sonra, geç viral genler, viral genom ile birlikte döl virion parçacıkları üretmek için bir araya gelen yapısal proteinleri ifade eder. Virüsle enfekte olmuş hücreler parçalanır ve viryonları serbest bırakır.
Metilselüloz virüs hareketini kısıtlar, viryonların sadece komşu hücreleri enfekte etmesine ve ardından parçalanmasına neden olarak tek tabakada delikler oluşturur.
İnkübasyon sonrası, metilselüloz kaplamayı çıkarın. Etanolik kristal viyole çözeltisi ekleyin. Etanol hücreleri düzeltir ve virüsleri etkisiz hale getirirken, kristal viyole hücreleri lekeler. Sonuç olarak, mor hücre tek tabakası üzerinde berrak parçalanmış bölgeler veya plaklar belirir.
Enfeksiyöz virüs titresini veya konsantrasyonunu belirlemek için her virüs seyreltmesinde her bir kuyucuktaki plakları sayın.
Hücre kültürü ortamını bir pipet kullanarak bir veya iki kuyucuktan çıkarın. Dikkatlice, seyreltilmiş virüs örneğini, her bir oyuğun yanından damla damla olacak şekilde, her bir hücre tek katmanına damla damla ekleyin.
Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar her bir veya iki kuyucuk için işlemi tekrarlayın. Tüm plakayı elinizle nazikçe sallayın.
Ardından, virüsün adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. Her 10 dakikada bir, plakayı inkübatörden çıkarın, virüsü her bir oyuğa daha eşit bir şekilde yaymak için tekrar hafifçe sallayın ve ardından inkübatöre geri koyun.
Yanlışlıkla emilmeyen inokulum sayma olasılığını azaltmak için, virüs örneğini 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak kuyulardan çıkarın ve örneği bir atık behere atın.
Plakaya 2,5 mililitre metilselüloz kaplama yerleştirin ve tekrar inkübatöre yerleştirin. Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak çamaşır suyu, iyodofor veya benzer bir virüs öldürücü ilavesiyle dezenfekte edin.
İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz kaplamayı bir pipet kullanarak bir seferde bir veya iki kuyudan çıkarın ve bir atık kabın içine yerleştirin. Her oyuğa yaklaşık 2 mililitre% 1 kristal viyole ve% 50 etanol ekleyin. Plakayı, leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Bu noktada, daha önce gösterildiği gibi atık kabı dezenfekte edin. Plakaları, akış temizlenene kadar musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın.
Her seyreltme serisinde plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun.