JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 5:32 dk • July 8th, 2025
Mikrobiyal patojenle enfekte olmuş konak hücreler apoptozla programlanmış hücre ölümüne uğrar. Apoptoz sırasında, DNazlar kromozomal DNA'yı küçük parçalara ayırarak hücre ölümüne yol açar.
TUNEL testini kullanarak apoptozu tespit etmek için, bir mantar patojeni ile enfekte olmuş deparafinleştirilmiş ve rehidre edilmiş bir cilt dokusu bölümü olan bir cam slayt alın.
Hücresel DNazları etkisiz hale getirmek için dokuyu proteinaz-K ile tedavi edin ve analiz sırasında DNA'yı potansiyel olarak bozmalarını önleyin. Reaksiyonu söndürmek için hidrojen peroksit ekleyin ve reaksiyona girmemiş proteinaz-K'yi çıkarmak için slaydı yıkayın.
Digoksigenin etiketli deoksi-üridin trifosfatlar veya dUTP'ler içeren bir tampon ekleyin. Bir terminal deoksinükleotidil transferaz, TdT enzimi ile destekleyin ve inkübe edin. Apoptotik hücrelerde, TdT enzimi, etiketli dUTP'lerin parçalanmış DNA'nın açıkta kalan 3'-hidroksil gruplarına bağlanmasını katalize eder.
Daha sonra, bir rodamin raportörüne konjuge edilmiş bir anti-digoxigenin antikoru ekleyin ve görüntüleme sırasında kırmızı floresan veren digoksigenin etiketli dUTP'lere antikor bağlanmasını kolaylaştırmak için karanlıkta inkübe edin.
Çekirdeği görselleştirmek için doku örneklerini floresan bir nükleer karşı boya ile tedavi edin. Doku bölümünün üzerine bir lamel yerleştirin ve bir floresan mikroskobu altında görselleştirin.
Mavi floresan, doku bölümündeki tüm hücrelerin çekirdeklerini tanımlamaya yardımcı olurken, rodamin lekeli hücrelerde kırmızı floresan varlığı, apoptoza bağlı DNA parçalanmasını gösterir.
Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi örnek doku ile hidrofilik cam slaytlar hazırlayın.
Doku bölümlerini deparafinize etmek için, slaytları bir coplin kavanozunda her biri 5 dakika boyunca ksilen ile üç kez yıkayın. Daha sonra, slaytları her biri 5 dakika boyunca iki kez% 100 etanol ile yıkayın. Bundan sonra, slaytları her biri% 95 etanol ve% 70 etanol ile 3 dakika yıkayın, ardından slaytları bir kez PBS ile 5 dakika yıkayın.
Deneysel ve negatif kontrol slaytları hazırlamak için, doğrudan slaytlara taze seyreltilmiş Proteinaz K ekleyerek dokuya ön işlem uygulayın. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından slaytları PBS'de her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkayın.
Pozitif kontrol slaytları hazırlamak için, dokuyu DN tamponu ile ön işlemden geçirin, ardından slaytları oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bundan sonra, DN tamponu içinde çözünmüş DNaz I, mililitre başına 0.1 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar çözülür. Hazırlanan DNA solüsyonunu slaytlara ekleyin. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin, ardından kenarlarını damıtılmış suyla bir coplin kavanozunda her biri 3 dakika olmak üzere beş kez yıkayın.
Reaksiyonu PBS'de% 3 hidrojen peroksit içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca söndürün. Ardından, slaytları PBS'de her biri iki dakika boyunca iki kez yıkayın. Ardından, slaytlar üzerindeki dokuya denge tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 10 saniye inkübe edin, ardından doku bölümünün etrafındaki fazla sıvıyı hafifçe vurun.
Terminal deoksinükleotidil transferaz enzimini reaksiyon tamponunda seyreltin, ardından deneysel ve pozitif kontrol slaytları üzerindeki dokuya ekleyin. Nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin.
Bundan sonra, slaytları durdurma tamponunun çalışma konsantrasyonunu içeren bir coplin kavanozuna yerleştirin. 15 saniye çalkalayın ve ardından slaytları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları PBS ile her biri 1 dakika boyunca üç kez yıkayın ve fazla sıvıyı boşaltın.
Daha sonra, oda sıcaklığına önceden ısıtılmış anti-digoxigenin konjugatını doğrudan doku üzerine ekleyin. Slaytları nemlendirilmiş karanlık bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Kuluçka tamamlandıktan sonra, slaytları PBS ile her biri iki dakika boyunca dört kez yıkayın. Fazla sıvıyı boşaltın. Ardından, yanlara montaj ortamı ekleyin. Slaytlardaki montaj ortamına 15 mikrolitre DAPI solüsyonu ekleyin. Her slaytı bir lamel ile örtün ve oje ile kapatın. Slaytların karanlıkta kurumasını bekleyin.
Bir floresan mikroskobu kullanarak, boyama işleminin tamamlanmasının hemen ardından slaytları gözlemleyin.
Her cilt bölümü boyunca rastgele aralıklarla 400 kez fotoğraf çekin. Hayvan başına deri bölümü başına en az 100 hücrenin görünür olduğundan emin olmak için DAPI lekeli mavi hücreleri sayın. Ardından, net hücre kenarları olan kırmızı tek hücreler olarak görünen TUNEL pozitif hücrelerin sayısını sayın.