JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 2:54 dk • July 8th, 2025
Kaspaz-3 ve kaspaz-7, hedef proteinlerdeki DEVD tetrapeptit dizisini tanıyan ve bunları aspartik asit kalıntısının C-terminalinde parçalayan proteazlardır. Bunlar apoptoz - programlanmış hücre ölümü - kaskadda önemli bir rol oynar.
Apoptotik hücrelerde kaspaz-3/7 aktivitesini değerlendirmek için, apoptoza neden olan mantarlarla enfekte olmuş bir kurbağa parmağı derisi eksplant içeren bir tüp ile başlayın. Tüpe uygun bir tampon ve birkaç metalik boncuk ekleyin.
Cilt hücrelerini bozmak ve kaspaz-3/7 proteinleri de dahil olmak üzere hücresel içerikleri serbest bırakmak için boncuk çırpma kullanın. Tüpü, peletleme hücresi kalıntılarını ve organelleri santrifüjleyin. Protein açısından zengin süpernatanı tüpten aspire edin ve çok kuyulu bir tahlil plakasının kuyucuklarına pipetleyin.
Kuyucukları luminojenik kaspaz reaktifi ile destekleyin. Bu reaktif, ATP, magnezyum iyonları ve lusiferaz enzimi içeren tamponlu bir çözelti içinde DEVD peptidini içeren prolüminesan bir substrattan oluşur.
Kuyu içeriğini karıştırın ve inkübe edin. İnkübasyon sırasında, kaspaz-3/7 prolüminesan substratı parçalar ve lusiferaz için bir substrat olan aminolusiferini çözeltiye salgılar.
ATP ve magnezyum iyonlarının varlığında, lusiferaz salınan aminolusiferini oksitleyerek biyolüminesan bir ürün oluşturur. Reaksiyon sırasında üretilen ışık miktarı, kaspaz aktivitesi ile orantılıdır.
Dondurulmuş bir kurbağa parmağı örneğinden proteinleri çıkarmak için, örneği 100 mikrolitre örnek tamponu ve iki paslanmaz çelik boncuk içeren 1,5 mililitrelik vidalı kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
Hücreleri parçalamak için maksimum hızda bir boncuk çırpıcı kullanın. Bundan sonra, tüpü 3 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, ardından süpernatanı toplamak için tüpü santrifüjleyin.
Kaspaz 3/7 testini 384 oyuklu bir plakada gerçekleştirmek için, boş olarak 10 mikrolitre numune tamponu ve üçlü olarak 10 mikrolitre protein özütü ekleyin. Ardından, piyasada bulunan 10 mikrolitre kaspaz 3/7 reaktifini protein ekstraktına ve boş kuyucuklara pipetleyin. Ardından, iki reaktifi karıştırmak için plakayı 15 saniye boyunca hafifçe çalkalayın.
Oda sıcaklığında ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Son olarak, numunenin lüminesansını ölçmek için ışıldayan bir plaka okuyucu kullanın.