JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 2:54 dk. • July 8th, 2025
Kaspaz-3 ve kaspaz-7, hedef proteinlerdeki DEVD tetrapeptit dizisini tanıyan ve bunları aspartik asit kalıntısının C-terminalinde parçalayan proteazlardır. Bunlar apoptoz - programlanmış hücre ölümü - kaskadda önemli bir rol oynar.
Apoptotik hücrelerde kaspaz-3/7 aktivitesini değerlendirmek için, apoptoza neden olan mantarlarla enfekte olmuş bir kurbağa parmağı derisi eksplant içeren bir tüp ile başlayın. Tüpe uygun bir tampon ve birkaç metalik boncuk ekleyin.
Cilt hücrelerini bozmak ve kaspaz-3/7 proteinleri de dahil olmak üzere hücresel içerikleri serbest bırakmak için boncuk çırpma kullanın. Tüpü, peletleme hücresi kalıntılarını ve organelleri santrifüjleyin. Protein açısından zengin süpernatanı tüpten aspire edin ve çok kuyulu bir tahlil plakasının kuyucuklarına pipetleyin.
Kuyucukları luminojenik kaspaz reaktifi ile destekleyin. Bu reaktif, ATP, magnezyum iyonları ve lusiferaz enzimi içeren tamponlu bir çözelti içinde DEVD peptidini içeren prolüminesan bir substrattan oluşur.
Kuyu içeriğini karıştırın ve inkübe edin. İnkübasyon sırasında, kaspaz-3/7 prolüminesan substratı parçalar ve lusiferaz için bir substrat olan aminolusiferini çözeltiye salgılar.
ATP ve magnezyum iyonları
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin