JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:48 dk • July 8th, 2025
Makrofajlar, fagositoz ile apoptoz programlanmış hücre ölümü geçiren hücreleri temizleyen özel bağışıklık hücreleridir.
Apoptotik hücre yutulmasını değerlendirmek için, hemositler - omurgasız makrofajlar tarafından yutulan apoptotik cisimler de dahil olmak üzere sabit Drosophila embriyonik hücrelerini içeren bir cam slaytla başlayın.
İlk olarak, hücrelere spesifik olmayan bölgeleri bloke eden bir bloke edici reaktif uygulayın. Croquemort reseptörlerini bağlayan birincil antikorları ekleyin - hemositlerin fagositik belirteçleri. Fazla antikorları yıkayın.
Birincil antikorlara bağlanan alkalin fosfataz işaretli ikincil antikorları ekleyin. Şimdi, lam üzerine uygun bir kromojenik substrat çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. İnkübasyon sırasında, alkalin fosfataz, hemositlerde mor lekeli granüller elde etmek için kromojenik substrat ile reaksiyona girer.
Daha sonra, terminal deoksinükleotidil transferaz, TdT enzimi ve digoksijenine bağlı nükleotidleri içeren bir reaksiyon karışımı ekleyin. TdT, digoksigenine bağlı nükleotidlerin, apoptotik cisimlerdeki parçalanmış DNA'nın açıkta kalan 3' OH uçlarına bağlanmasını katalize eder.
Daha sonra, DNA hasarı bölgesindeki nükleotidlere bağlanan peroksidaz raportörüne konjuge anti-digoksigenin antikorları ekleyin. Hücreleri peroksidaza özgü bir kromojenik substrat çözeltisi ile muamele edin ve inkübe edin. Peroksidaz, substratın oksidasyonunu katalize eder, renkli çökeltiler oluşturur ve apoptotik cisimleri kahverengiye boyar.
Son olarak, hücreleri bir ışık mikroskobu altında görselleştirin. Mor granüllerin ve hücrelerden gelen kahverengi sinyallerin bir arada bulunması, fagositozlu apoptotik cisimler içeren hemositleri gösterir.
Hücreleri anti-Croquemort antikoru ile immün boyamak için, önce slaytı seri olarak metanole batırın, ardından PBS% 0.2 Triton X-100 ile takviye edilmiş PBS, ardından tek başına PBS ile takviye edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS +% 0.2 Triton X-100'de 20 mikrolitre% 5 tam domuz serumu ile spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. Fazla bloke edici solüsyonu çıkarın ve hücreleri gece boyunca 4 santigrat derecede 20 mikrolitre anti-Croquemort antiserum ile etiketleyin.
Ertesi sabah, slaytı PBS + Triton X-100'de beş adet 10 dakikalık inkübasyon için yıkayın. Son yıkamadan sonra, slaytı PBS'de 10 dakika durulayın. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 20 mikrolitre alkalin fosfataz etiketli sıçan önleyici IgG ile etiketleyin.
İnkübasyonun sonunda, slaytı gösterildiği gibi PBS + Triton X-100'de beş kez yıkayın, ardından tampon çözeltisinde 10 dakika bekletin. Daha sonra hücreleri fosfataz substrat çözeltisi ile etiketleyin ve hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
Hemosit granüllerinde güçlü mor sinyaller göründüğünde, fazla substratı çıkarın ve slaytı 5 ila 10 dakika boyunca EDTA ile desteklenmiş tamponda bekletin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki adet 5 dakikalık PBS yıkama ile durulayın ve 10 dakika boyunca dengeleme tamponu ile muamele edin.
Çözeltiyi çıkardıktan sonra, hücreleri 1 saat boyunca 37 santigrat derecede 20 mikrolitre terminal deoksinükleotidil transferaz çözeltisi ile etiketleyin. Daha sonra, çözeltiyi slayttan çıkarın ve hücreleri 0.5 mililitre durdurma yıkama tamponunu 17 mililitre suda 10 dakika bekletin. Daha sonra, hücreleri 5 dakikalık üç PBS yıkama ile durulayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 mikrolitre anti-digoksigenin peroksidaz ile etiketleyin.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri gösterildiği gibi PBS'de dört kez yıkayın ve apoptotik hücreler kahverengiye dönene kadar 30 saniyelik artışlarla peroksidaz substratındaki slaytı ıslatın. Optimal bir boyama elde edildiğinde, peroksidaz reaksiyonunu durdurmak için slaytı suya batırın.