JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 7:16 dk • July 8th, 2025
Mayoz bölünmenin profaz-I'indeki oositler transkripsiyonel olarak aktiftir; mRNA'lar üretirler ve bunları hareketsiz bir formda depolarlar. Olgunlaşma sırasında, oosit metafaza girerken, depolanan mRNA'lar proteinlere çevrilir.
mRNA'nın translasyonunu incelemek için, bir damla ortamda asılı kalan faz-I tutuklu fare oositleri ile başlayın. Tutma pipetini yerinde tutmak için tek bir oositin yakınına yerleştirin.
Raportör karışımı içeren bir mikro enjeksiyon pipeti alın. Bu karışım iki farklı mRNA türü içerir, biri sarı floresan proteini kodlayan veya YFP - hedef genin 3'-çevrilmemiş bölgesi ile kaynaşmış bir raportör - ve kırmızı floresan proteini kodlayan bir poliadenillenmiş mRNA.
Raportör karışımını oosit içine enjekte edin. Mikroenjekte edilen oositleri, faz-I tutuklamasını koruyan kimyasal bir inhibitör olan silostamid ile takviye edilmiş bir olgunlaşma ortamında inkübe edin.
Oosit, kırmızı floresan yoğunluğu bir platoya ulaşana kadar poliadenillenmiş mRNA'yı çevirirken, poliadenilasyon kuyruğu olmayan YFP kodlayan mRNA seviyeleri bu şekilde kalır.
Tedavi edilen oositleri silostamid içermeyen bir olgunlaşma ortamına aktarın, bu da mayozun devam etmesine yardımcı olur; ve hedef mRNA, sarı floresan raportör ile kaynaşmış hedef proteini üretmek için translasyona uğrar.
Floresan sinyallerini düzenli aralıklarla görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
Enjekte edilen oositler sabit seviyelerde kırmızı floresan gösterirken, sarı floresan zamanla artar, bu da raportör proteinlerin translasyonunu ve kademeli birikimini gösterir.
Başlamak için, folikül duvarında 26 gauge iğne ile küçük bir kesi yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağızla çalıştırılan bir cam pipet kullanarak sağlam COC'leri birkaç kat kümülüs hücresi ile izole edin. Daha küçük bir pipet kullanın ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak temizleyin.
Soyulmuş oositleri aspire edin ve bunları 1 mikromolar silostamid ile desteklenmiş olgunlaşma ortamı olan bir Petri kabına yerleştirin. Oositlerin foliküllerden izole edilmelerinin neden olduğu stresten kurtulmasını sağlamak için çanağı iki saat boyunca bir inkübatöre koyun.
Enjeksiyon iğnelerini hazırlamak için 10 santimetre uzunluğunda bir borosilikat cam kılcal boru ve mekanik bir çektirme yerleştirin. Optimum enjeksiyon için ısıtılmış bir filament kullanarak iğne ucunu 45 derecelik bir açıyla bükün. 20 mikrolitrelik bazik oosit toplama ortamı damlacıklarını polistiren bir tabağa yerleştirin ve damlacıkları hafif mineral yağ ile kaplayın.
Her biri mikrolitre başına 12,5 mikrogram Ypet, UTR ve mCherry ekleyerek daha büyük hacimli bir raportör karışımı hazırlayın. Bunların altlarını eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çözüldükten sonra, alikotu 20.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin ve ardından yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Enjeksiyon iğnesine yaklaşık 0,5 mikrolitre raportör karışımı yükleyin. Tutma pipetini ve enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve bunları oosit toplama ortamının damlacığına yerleştirin.
Enjeksiyon iğnesini, tutma pipetine hafifçe vurarak açın. Oositleri bazik toplama ortamının bir damlacığına yerleştirin ve raportör karışımının 5 ila 10 pikolitresini enjekte edin. mCherry sinyalinin platoya ulaşmasını sağlamak için olgunlaşma ortamındaki oositleri 1 mikromolar silostamid ile 16 saat boyunca inkübe edin.
Hızlandırılmış mikroskopi için, enjekte edilen her raportör için iki adet 20 mikrolitrelik olgunlaşma ortamı damlası içeren bir Petri kabı hazırlayın. Profaz-I ile tutuklanan oositleri kontrol etmek için 1 mikromolar silostamid içeren bir damlacık ve olgunlaşan oositler için silostamid içermeyen bir damlacık. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.
Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve silostamid içermeyen olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Profaz-I oosit kontrol grubu olarak 1 mikromolar silostamid ile bazı oositleri olgunlaşma ortamında tutun.
Enjekte edilen oositleri önceden hazırlanmış hızlandırılmış mikroskop kabı üzerindeki ilgili damlacıklarına aktarın. Kayıt sırasında hareketlerini önlemek için oositleri kapalı bir cam pipetle kümeleyin.
Çanağı, metin el yazmasında belirtilen parametreleri kullanarak, ışık yayan bir diyot aydınlatma sistemi ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin.
"Uygulamalar"a ve ardından "Çok Boyutlu edinim"e tıklayarak hızlandırılmış deney için uygun ayarları girin. İlk sekme olan "Ana"yı seçin ve "Hızlandırılmış", "Çoklu aşama konumları" ve "Çoklu dalga boyları"nı seçin.
Deneyin kaydedilmesi gereken konumu girmek için "Kaydetme" sekmesini seçin. Ardından, zaman noktası sayısını, süreyi ve zaman aralığını girmek için "Hızlandırılmış" sekmesini seçin. "Sahne" sekmesini seçin. Brightfield'ı açın ve yeni bir pencere açıp "Al", "Al" ve "Canlı göster"i seçerek oositlerin konumunu bulun.
Oositler yerleştirildikten sonra, "Çok boyutlu alım penceresine" geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için "+" tuşuna basın. "Dalga boyları" sekmesini seçin ve brightfield, YFP ve mCherry için üç farklı dalga boyu ayarlayın. Ypet ve mCherry için pozlamayı ayarlayın. Ardından, "Al"a tıklayarak hızlandırılmış deneyi başlatın.
Ypet-3' UTR translasyonunun analizi için, her oosit için iki bölge ölçümü yapın. "Elips bölgesi" üzerine kırpılarak oositin kendisi ve oositi çevreleyen küçük bir bölge "Dikdörtgen bölge" ye tıklanarak arka plan çıkarma için kullanılacaktır. "Günlüğü aç"ı ve ardından "Verileri günlüğe kaydet"i tıklayarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya aktarın.
Her bir oosit için ve ölçülen tüm zaman noktaları için, arka plan bölgesi ölçümünü oosit bölgesi ölçümünden YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı çıkarın.