alamarBlue Testi: Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerindeki Sitotoksik Etkilerini Taramak İçin Hassas Bir Florometrik Yöntem

Gözyaşı filmi - gözü kaplayan koruyucu sıvı - oküler kornea epitel hücrelerinin, CEC'lerin sağlıklı, metabolik olarak aktif bir durumda yağlanmasına ve korunmasına yardımcı olur. Kuru göz hastalığında olduğu gibi bozulmuş bir gözyaşı filmi, CEC'lerden gözyaşı buharlaşmasına neden olarak enfeksiyona ve enflamatuar hasara karşı duyarlılıklarını artırabilir.

Yapay gözyaşı formülasyonları, gözyaşı filmini stabilize eder ve su tutulmasını iyileştirerek hücre dehidrasyonunu önler.

AlamarBlue testi kullanılarak bir test yapay gözyaşı formülasyonunun CEC'ler üzerindeki sitotoksik etkilerini taramak için, uygun ortamda insan kaynaklı CEC'lerin yapışkan bir kültürüyle başlayın. Medyayı atın.

Hücre kültürünü, yapay gözyaşı formülasyonunun belirli bir konsantrasyonu ile inkübe edin. Gözyaşı formülasyonu, hücrelerin üzerinde bir kaplama oluşturur. Oluşturan bileşenlerin kümülatif etkisine bağlı olarak, hücreler metabolik aktivitede bir kayıp yaşayabilir.

Ardından, mavi renkli, zayıf floresan, toksik olmayan, suda çözünür bir boya olan resazurin içeren alamarBlue solüsyonunu ekleyin.

Resazurin hücrelere yayılır ve metabolik olarak aktif hücrelerde, solunum-metabolik süreçlerin elektron donörlerinden elektronları kabul ettiği için esas olarak mitokondriyal redüktazlar tarafından geri dönüşümsüz olarak azalır ve pembe renkli, oldukça floresan bir resorufin oluşturur, hücrelerden çözeltiye serbestçe hareket eder. Resorufin içeren çözeltiyi çok kuyulu taze bir plakaya aktarın.

Bir floresan plaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün. Düşük bir floresan yoğunluğu değeri, düşük bir hücresel metabolik aktiviteyi gösterir ve gözyaşı formülasyonunun CEC'ler üzerindeki istenmeyen etkilerini düşündürür.

Kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri hemen 150 mikrolitre bir test formülasyonu veya ortam kontrol çözeltisi ile muamele edin. Ardından, hücreleri 30 dakika inkübe edin.

Test solüsyonunu hücrelerden çıkarın ve 0.5 mililitre% 10 metabolik boya solüsyonu ekleyin. Hücreleri dört saat daha inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, her oyuktan 100 mikrolitre boya çözeltisini çıkarın ve 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Her kuyucuğun floresansını ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın, uyarımı 540 nanometreye ve emisyonu 590 nanometreye ayarlayın.