JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:21 dk. • July 8th, 2025
Böcek orta bağırsağı, bağırsak asitlenmesinden sorumlu olan bir bakır hücre bölgesi - CCR - içerir. Bu bölge, komşu interstisyel hücreler tarafından oluşturulan dar kanaldan geçen asit üreten özel salgı hücreleri - bakır hücreler - içerir. Asit, sindirime yardımcı olmak için bağırsak lümenine salınır.
Drosophila'da bağırsak asitlenmesini izlemek için, yeterli bir süre aç kalan yetişkin sinekleri alın. Sinekleri, bromofenol mavisi veya pH algılayıcı bir gösterge boyası olan BPB ile takviye edilmiş tek bir damla sinek yemi içeren bir Petri plakasına yerleştirin. Açlıktan ölen sineklerin belirli bir süre boyunca yiyecek aramasına izin verin.
Gıdaların yutulmasından sonra, bakır hücreler tarafından üretilen asit bağırsak lümenine ulaşır ve BPB içeren gıdalarla karışır. Asidik bir pH'ta, BPB molekülleri protonlanır, bu da renklerini maviden sarıya değiştirir - asitleşmeyi gösterir.
Deney süresinin tamamlanmasının ardından Petri plakasını buzun üzerine yerleştirin. Düşük bir sıcaklık, sineklerde nöromüsküler aktiviteyi durdurur ve onları uyuşturur. Stereomikroskop altına tek bir sinek yerleştirin ve sağlam sindirim sistemini cerrahi olarak izole edin.
Bağırsak asitlenmesinin durumunu belirlemek için CCR rengini inceleyin. Sarı renklenme asitleşmeyi gösterirken, mavi renklenme asitleşmenin olmadığını gösterir.
Tüm sineklerin sindirim sistemini inceleyin ve bağırsak asitlenmesi gösteren bireylerin yüzdesini hesaplayın.
pH algılayıcı bromofenol mavisi veya BPB boyası ile sinek yeminin hazırlanmasıyla bağırsak asitifikasyonu izleme testi için düzenlemeye başlayın. Bunu yapmak için, sinek yemini bir mikrodalgada eritin ve ılık olana kadar soğumaya bırakın. 1 mililitre ılık yiyeceğe 1 mililitre %4 BPB ekleyin. Bir pipet kullanarak, BPB içeren sinek yemini bir Petri kabının ortasındaki yaklaşık 200 mikrolitrelik tek bir noktaya ekleyin.
Daha sonra, 0 ila 2 günlük bakire olmayan, dişi, Drosophila melanogaster sineklerini toplayın ve sineklerin standart mısır unu yemi ile iyileşmesine izin verin. Deneyden önce, sinekleri yaklaşık 2 mililitre deiyonize su ile ıslatılmış bir laboratuvar mendil dokusu içeren bir şişede oda sıcaklığında 24 saat aç bırakın.
Aç sinekleri, ışığa maruz kaldıklarında oda sıcaklığında dört saat boyunca yiyecek aramalarına izin vermek için% 2 BPB ile desteklenmiş% 2 BPB ile desteklenmiş taze hazırlanmış sinek yeminin tek noktalarını içeren bir Petri kabına aktarın.
Dört saat sonra sinekleri toplayın. Ardından, anestezi uygulanmış sineklerin bağırsaklarını stereomikroskop altında forseps ile 1x PBS'de cerrahi olarak izole etmeye devam edin. Bağırsaklarda sağlam BPB lekelenmesi gösteren sineklerin sayısını sayın ve denklemi kullanarak yüzdeyi hesaplayın.