Mitokondriyal Kalsiyum Alım Testi: İzole Mitokondride Kalsiyum Alımını Ölçmek İçin Plaka Okuyucu Tabanlı Bir Yöntem

Mitokondri, düzgün çalışması için gerekli olduğu için sitozolik kalsiyumu alır.

Mitokondriyal matrise aşırı kalsiyum akışı - mitokondriyal kalsiyum aşırı yüklenmesi - bir iç zar kanalının, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneğinin veya MPTP'nin açılmasını tetikler. Açılan gözenek, mitokondriden kalsiyum akışının artmasına izin vererek mitokondriyal disfonksiyona neden olur.

Mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için, uygun bir tampon içinde süspanse edilmiş izole mitokondri içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın. Kuyucuğu, ATP üreten substratlar olan piruvat ve malat ile destekleyin. Kuyu içeriğini karıştırın ve inkübe edin.

Kuluçka sırasında, piruvat ve malat, mitokondriye enerji veren ATP'lere dönüştürülür. Mitokondriyal membran geçirimsiz, kalsiyuma duyarlı floresan boya molekülleri içeren bir çözelti ekleyin. Kalsiyum içeren tamponu enerjili mitokondriye dağıtın.

Boya molekülleri tampondaki serbest kalsiyuma bağlanırken boyanın kalsiyum floresansını izleyin.

Mitokondriyal kalsiyum akışını başlatmak için daha fazla kalsiyum iyonu ekleyin. Yavaş yavaş artan mitokondriyal kalsiyum, tampondaki kalsiyum iyonlarını azaltarak boyanın kalsiyum floresansını azaltır.

Mitokondri maksimum kalsiyum taşıma kapasitesine ulaştığında, kalsiyum iyonlarının daha fazla eklenmesi MPTP kanallarını açar ve kalsiyumu tampona aktarır. Tampon kalsiyum, boya moleküllerine bağlanarak boya kalsiyum floresansının artmasına neden olur.

Mitokondriyal kalsiyum alımının kinetiğini izlemek için kalsiyum ilavesinin farklı zaman noktalarında boya floresansını çizin.

Bir plaka okuyucu kullanarak mitokondriyal kalsiyum alım ölçümünü başlatmak için, okuyucuyu toplam 5 saniye boyunca her saniye kalsiyum yeşili-1,000N floresansının kinetik okumasını gerçekleştirecek şekilde programlayın.

Reaktif enjektörlerini, çeşitli zaman noktalarında 5 mikrolitre kalsiyum klorür çözeltisi dağıtacak şekilde programlayın. Ardından enjektörleri kullanılacak kalsiyum klorür çözeltisi ile doldurun.

Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 200 mikrogram izole mitokondri ekleyin ve toplam 197 mikrolitre hacim elde etmek için uygun hacimde potasyum klorür tamponu ekleyin. Daha sonra 1 mikrolitre 1 molar piruvat, 1 mikrolitre 500 milimolar malat ve 1 mikrolitre 1 milimolar kalsiyum yeşili-5N stoğu ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın.

Mitokondrinin enerjik hale gelmesi için oda sıcaklığında 2 dakika ışıktan korunarak inkübe edin. Son olarak, önceden programlanmış kinetik protokolü başlatın ve kalsiyum yeşili-5N floresansını izleyin.