Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Hücreye nüfuz eden peptitler, CPP'ler, kısa, pozitif yüklü peptitler, hücre geçirimsiz kargoların verilmesini kolaylaştırarak hücre zarlarıyla etkileşime girebilir ve onları geçebilir.

Bir

hücre zarı taklidi kullanarak in vitro bir test CPP'sinin zar geçirgenleştirme potansiyelini incelemek için, büyük bir uniilamellar vezikül, LUV, süspansiyon ile başlayın.

LUV'ler, membran geçirimsiz bir floresan prob ve karşılık gelen söndürücü çifti ile yüklenmiş bir fosfolipid çift tabakası içerir. Veziküller içinde, söndürücü, yakınlıkları nedeniyle floresan prob ile etkileşime girerek floresan söndürmeye neden olur.

LUV süspansiyonunu bir kuvars floresan küvetine pipetleyin ve tampon kullanarak seyreltin. Manyetik bir çubuk ekleyin. Çalışma sırasında LUV sedimantasyonunu önlemek için manyetik karıştırmalı bir spektroflorometreye aktarın. Herhangi bir LUV sızıntısını ortadan kaldırmak için arka plan floresansını belirleyin.

İstenilen CPP konsantrasyonunu LUV süspansiyonuna düzenli aralıklarla ekleyin.

CPP'lerin amino asit kalıntılarının hidrofobikliğine ve yüküne bağlı olarak, LUV lipid zarını bozarak zar penetrasyonuna ve geçirgenleşmeye yol açarlar.

Vezikül zarı hasarı, floresan probun sızmasına ve söndürücünün çevredeki çözeltiye sızmasına neden olarak mekansal ayrılmalarını arttırır. Sonuç olarak, prob floresan gösterir.

Daha fazla CPP çözeltisi ilavesi, LUV geçirgenliğinin ve floresan yoğunluğunun artmasına yol açar. CPP ilavesi ile floresan yoğunluğundaki bir artış, peptidin membran geçirgenleştirme potansiyelini gösterir.

Floresan sızıntısını ölçmek için, LUV'leri bir kuvars floresan küvetinde 1 mililitre HEPES Tampon 2 içinde 100 mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin ve deney sırasında çözeltinin homojenizasyonunu kolaylaştırmak için manyetik bir karıştırıcı ekleyin.

Sonraki 900 saniye boyunca peptit çözeltisinin alikotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak sızıntıyı ölçmeden önce, arka plan floresansını değerlendirmek için ilk 100 saniye boyunca LUV'leri tek başına ölçün.

Pozitif bir kontrol olarak %100 floresan sızıntısını ölçmek için, vezikülleri çözündürmek için LUV'lere 1 mikrolitre Triton X-100 ekleyin, bu da analizin son 100 saniyesinde probun tamamen sönmesine neden olur. Ardından, her bir zaman noktasındaki sızıntı yüzdesini hesaplamak için formülü kullanın.