Bitki dokularındaki çözünür protein içeriğini ölçmek için çözünür protein tahlili

Bir bitki dokusundaki, bir tüpteki çözünür protein içeriğini ölçmek için, uygun miktarda öğütülmüş, liyofilize bitki dokusu ile başlayın.

Tüpe bir alkali olan sodyum hidroksit ekleyin ve sonikat ekleyin. Mekanik kuvvetlere sahip alkali ortam, hücreleri bozar ve makromoleküller - çözünür proteinler ve karbonhidratlar dahil olmak üzere hücre içi içerikleri serbest bırakır. Daha yüksek sıcaklıklarda inkübe edin.

Isı varlığında, alkali protein hidrolizine neden olur, daha küçük peptitler oluşturur ve protein çözünürlüğünü arttırır. Ek olarak, karbonhidratlar bozulur.

Karışımı santrifüjleyin. Çözünmüş protein içeren süpernatanı toplayın. PH'ı nötralize etmek için hidroklorik asit ekleyin.

Numuneyi trikloroasetik asit, TCA ile muamele edin. TCA, proteinleri çevreleyen hidrasyon kabuğunu bozarak protein toplanmasına ve çökelmesine yol açar.

TCA içeren süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Çözünür protein tahminini engelleyebilecek kalıntı TCA'yı gidermek için protein peletini buz gibi soğuk asetonla yıkayın.

Asetonu havayla kurutun. Protein peletini sodyum hidroksit içinde yeniden süspanse edin. Deiyonize su ile seyreltin. Çok kuyulu bir plakanın kuyularına aktarın.

Asidik bir Coomassie Brilliant Blue G-250 boya çözeltisi ekleyin. Asidik koşullar altında, boya, çözündürülmüş proteinlerdeki bazik amino asit kalıntılarına bağlanır ve mavi bir protein-boya kompleksi ile sonuçlanır.

Bitki dokusundaki çözünür protein içeriği ile orantılı olarak protein-boya kompleksinin emilimini ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.

Başlamak için, her dokunun kopya örneklerini etiketli 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine tartın. Ardından, her bir numunenin kesin kütlesini kaydedin. Bir mikro pipetleyici kullanarak, her tüpe 500 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin. Kapakları sıkıca kapatın ve tüpleri 30 dakika boyunca sonikleştirin.

Ardından, tüpleri 15 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir sıcak su banyosuna yerleştirin. Bundan sonra, tüpleri 10 dakika boyunca 15.000 g'da santrifüjleyin. Her numune için yeni bir pipet ucu kullanarak süpernatanı yeni etiketli mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin.

Peletin içine 300 mikrolitre 0.1 molar sodyum hidroksit ekleyin ve santrifüjlemeyi 10 dakika boyunca tekrarlayın. Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve ilk santrifüjlemeden süpernatanı içeren tüplere aktarın.

Süpernatantın pH'ını nötralize etmek için 11 mikrolitre 5.8 molar hidroklorik asit ekleyin. PH'ın yaklaşık 7 olduğunu doğrulamak için turnusol kağıdı kullanın.

Ardından, her tüpe 90 mikrolitre %100 trikloroasetik asit ekleyin. Ardından, tüpleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri 13.000 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Dikkatlice, trikloroasetik asidi çıkarmak için bir vakum hattı ve cam mikropipet ucu kullanın.

Emme ucu ile peleti rahatsız etmemeye çok dikkat edin.

Daha sonra, peleti eksi 20 santigrat dereceye soğutulmuş 100 mikrolitre asetonla yıkayın. Ardından, asetonun bir davlumbazda buharlaşmasına izin verin. Protein peletini 1 mililitre sodyum hidroksit ile çözün. Ek ısıtma, girdap ve sonikasyon turları gerekebilir.

Her bir IgG standart çözeltisinden 160 mikrolitreyi, A1 konumundan başlayarak üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Daha sonra, 1.5 mililitrelik yeni bir tüpte, 950 mikrolitre damıtılmış suya her numune çözeltisinden 50 mikrolitre ekleyin. Ardından, her seyreltilmiş numuneden 60 mikrolitreyi, H1 konumundan başlayarak üç kopya halinde kuyu plakasına ekleyin. Tüm boş ve bilinmeyen numune kuyucuklarına 100 mikrolitre damıtılmış su ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakanın her bir oyuğuna 40 mikrolitre Coomassie parlak mavi G-250 protein boyası ekleyin. Bir iğne kullanarak, kuyucuklarda bulunan kabarcıkları patlatın. Bundan sonra, plakanın oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, 595 nanometrede her bir kuyucuk için absorbans değerlerini kaydetmek için bir mikroplaka spektrofotometresi kullanın.