Hücre İçi Parazit Üremesini Ölçmek için Luciferaz Bazlı Büyüme Testi

Tek hücreli bir protozoan olan Toxoplasma gondii, yalnızca konakçı hücrelerin içinde çoğalan zorunlu bir anaerobik parazittir.

Lusiferaz bazlı bir tahlil kullanarak parazitin hücre içi büyümesini ölçmek için, substratı ile reaksiyona girdiğinde lüminesans üreten bir enzim olan lusiferazı eksprese eden parazit hücrelerinin bir süspansiyonunu alın. Süspansiyonu bir insan sünnet derisi fibroblast kültürüne ekleyin ve yeterli bir süre inkübe edin.

Parazit, konakçı hücre reseptörlerine bağlanır ve endositik bir süreçle içselleştirilir ve parazitoforöz bir vakuol oluşturur. Yapı, parazitin üremesi için bir niş sağlar.

Enfeksiyon sonrası, içselleştirilmemiş parazitleri uzaklaştırarak ortamı aspire edin. Bir deterjan ve lusiferin içeren bir lizis tamponu ekleyin - lusiferaz için bir substrat. Tampondaki deterjan, hücre zarında gözenekler oluşturur ve hücreleri tamamen parçalayarak lusiferaz salınımına neden olur.

Serbest bırakılan enzim, lusiferin moleküllerini oksitleyerek ışık yayar. Lusiferaz aktivitesini belirlemek için lüminesans yoğunluğunu ölçün. Enfekte konakçı hücreleri içeren replikasyon kuyucuklarını kullanarak, enfeksiyon sonrası önceden belirlenmiş aralıklarla lusiferaz aktivitesini ölçün.

Zaman içinde parazit büyümesindeki kıvrım değişikliklerini elde etmek için normalleştirilmiş lüminesans yoğunluğunu zaman aralıklarına karşı çizin. Yoğunluktaki zamansal bir artış, başarılı parazit çoğalmasını gösterir.

Parazitin iki katına çıkma süresini temsil eden eğrinin eğimini hesaplamak için değerleri logaritmik bir ölçekte çizin.

Lusiferaz bazlı bir Toxoplasma büyüme testi yapmak için, insan sünnet derisi fibroblastlarının önceden tohumlanmış 96 oyuklu mikroplaka kültürlerinden ortamı dikkatlice aspire ederek başlayın ve 150 mikrolitre parazit içermeyen süspansiyonu üç sütunlu, beş sıralı bir formatta kuyucuklara aşılayın.

Hücre kültürü inkübatöründe dört saatlik bir inkübasyondan sonra, istila edilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için ortamı her bir oyuktan dikkatlice aspire edin ve her birindeki kuyucukları oda sıcaklığında fenol kırmızısı içermeyen ortamla doldurun. Daha sonra, PBS'de 100 mikrolitre 12.5 mikromolar lusiferaz substrat çözeltisini, üst sıranın her bir oyuğuna ekleyin ve tam hücre lizizine izin vermek için mikroplakaları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, bir mikroplaka okuyucusunda lusiferaz aktivitesini ölçün. Her okuma, enfeksiyondan dört saat sonra istila edilen parazitlerin ilk sayısını temsil eder. Ortamı değiştirmeden önümüzdeki dört gün boyunca analizi her 24 saatte bir tekrarlayın.

Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kıvrım değişimini hesaplamak için, her okuma enfeksiyondan dört saat sonra ilk okumaya bölünebilir. Parazit büyümesinin normalleştirilmiş kıvrım değişiminin log2'si daha sonra her bir zaman noktasına karşı çizilebilir ve iki katına çıkma süresini temsil eden eğimi elde etmek için doğrusal bir regresyon fonksiyonuna tabi tutulabilir.