JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:14 dk. • July 8th, 2025
Mitokondriyal dış zardaki bir ATPaz olan Msp1, yanlış lokalize kuyruk bağlantılı veya TA, proteinleri heksamerik merkezi gözeneği yoluyla zardan uzaklaştırır ve bozulmalarını kolaylaştırır.
Translokasyon mekanizmasını anlamak için, TA proteinlerini ve Msp1'i lipozomlara birlikte yeniden yapılandırarak lipid çift tabakasına entegrasyonlarını sağlar.
Sulandırılmış lipozomları, şaperonlar - sitozolik kalite kontrol proteinleri içeren uygun bir tampona ekleyerek bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Şaperonlar glutatyon-S-transferaz veya GST enzimi ile etiketlenir.
Reaksiyona adenozin trifosfat - ATP - ekleyin. Msp1, ATP moleküllerine bağlanır ve onları hidrolize eder. Hidroliz ile üretilen enerjiyi kullanan Msp1, zara bağlı TA proteinlerini merkezi gözeneği boyunca yer değiştirir. Reaksiyon karışımındaki şaperonlar, ekstrakte edilen TA proteinlerinin transmembran alanına bağlanır.
Ardından, reaksiyon karışımını bir afinite saflaştırma kolonuna yükleyin. Kolon, indirgenmiş glutatyon veya GSH ile konjuge edilmiş bir reçine içerir. Şaperonlar üzerindeki GST proteini, konjuge GSH'ye - substratına - bağlanır ve şaperon-TA protein komplekslerini reçineye bağlar.
Hala lipozomlara entegre olan T
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin