Test İlacına Maruz Kalma Üzerine Beyin Dilimlerinden Monoamin Salınımını Ölçmek için Plaka Bazlı Bir Test

Monoamin nörotransmiterler, endojen kimyasal haberciler, nöronlar arasındaki temas noktası olan sinaps boyunca sinyalleri iletir. Sıkı bir şekilde düzenlenmiş monoamin nörotransmitter sistemi, normal nöronal fonksiyon için gereklidir.

Bir test ilacının ex vivo monoamin salınımı üzerindeki etkisini taramak için, doku canlılığını koruyarak, soğutulmuş oksijenli bir tamponda ilgilenilen bölgeyi içeren sıçan beyin dokusu dilimleri elde edin.

Doku dilimlerini, gaz halindeki bir karışım kaynağına bağlı ve monoamin oksidaz inhibitörleri ile desteklenmiş oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı, aCSF içeren gözenekli filtre ekleri ile çok kuyulu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Kuluçkaya yatmak.

İnhibitörler hücrelere yayılır ve monoamin oksidaz enzimlerini inaktive eder, monoaminlerin bozulmasını önler ve depolama ve salım için mevcut konsantrasyonlarını arttırır.

Doku içeren ekleri oksijenli aCSF ve test ilacını içeren kuyucuklara aktarın. Kuluçkaya yatmak. İlaç, monoamin nörotransmitter sistemini uyarabilir, ekstranöronal boşluktaki monoamin konsantrasyonunu artırabilir ve bunların beyin dokusundan çözeltiye salınmasına yol açabilir.

Serbest bırakılan monoaminler, dokudan ayrılarak gözenekli eklerden kuyucuklara geçer.

İnkübasyon sonrası, doku dilimi içeren ekleri çıkarın. Monoamin çözeltisini, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, HPLC ile uyumlu bir çözücü içeren bir tüpte toplayın. Tüp içeriğini önceden monte edilmiş filtre ünitelerine aktarın. Santrifüj, büyük kirleticileri giderir.

Elde edilen filtratı HPLC kolonuna yükleyin ve monoamin salınımı üzerindeki test ilacı etkisinin göstergesi olan monoamin konsantrasyonunu belirlemek için bir kromatografi çalışması gerçekleştirin.

Monoamin salınımını indüklemek için, doku numunelerini, sabit, hafif köpürme ile oyuk başına 0,5 ila 1 mililitre akış tamponu içeren özel yapım 48 oyuklu bir akış odasının her bir oyuğuna aktarın ve numunelerin 37 santigrat derecede 30 ila 50 dakika boyunca iyileşmesine izin verin.

Dengeleme süresinin sonunda, doku tutucuyu beyin dokusu ile birlikte, farmakolojik ajan olsun veya olmasın 500 mikrolitre oksijenli akış tamponu içeren kuyucuklara taşıyın, 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyon için kuyular arasında minimum tampon transferini önlemek için tutucuyu kuyunun kenarına vurun.

İnkübasyonun sonunda, tutucuyu, ilgilenilen ilaç olsun ya da olmasın, 500 mikrolitre akış tamponu içeren yeni bir kuyucuk setine taşıyın ve plakayı 20 dakika daha hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

İkinci inkübasyon sırasında, çözeltiyi ilk inkübasyondan gelen kuyulardan buz üzerinde 50 mikrolitre 1 N perklorik veya fosforik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve tüpleri #1 olarak etiketleyin.

İkinci inkübasyonun sonunda, doku tutucuyu buz üzerindeki plaka ile boş kuyucuklara hareket ettirin ve ikinci inkübasyondan süpernatanları buz üzerinde 50 mikrolitre 1 N perklorik veya fosforik asit içeren yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Bu tüpleri #2 olarak etiketleyin.

Tüm süpernatantlar transfer edildiğinde, her bir doku oyuğuna 1 mililitre buz gibi soğuk diseksiyon tamponu ekleyin ve her doku örneğini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için küçük cımbız kullanın. Tamponu numune tüplerinden çıkarın ve dokuları -80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, toplanan inkübasyon çözeltilerini santrifüjleme için mikrosantrifüj filtre tüplerine aktarın ve süzüntüyü HPLC analizine kadar buzun üzerine yerleştirin.