JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 2:52 dk • July 8th, 2025
Aort kapak broşürleri, hücre dışı matris katmanları boyunca dağılmış heterojen bir kapak interstisyel hücreleri veya VIC popülasyonu içerir. Stimülasyon üzerine, VIC'ler osteoblastlara dönüşür - kemik matrisi oluşturan hücreler.
Olgun osteoblastlar kollajen ve kemik matris proteinleri salgılar. Bu proteinler osteoblastların matrise bağlanmasına yardımcı olur. Son olarak, hücre içi kalsiyum iyonları matriks ortamına girer ve fosfatlarla birlikte mineralize nodüller halinde birikerek aort kapak kalsifikasyonuna yol açar.
Kalsifiye aort kapaklarındaki kalsiyum konsantrasyonunu değerlendirmek için, altı oyuklu bir plakada bir VIC kültürü ile başlayın. Kültür ortamını atın, kuyucuğa bir osteojenik ortam ekleyin ve inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, osteojenik ortamdaki insülin, VIC'leri osteojenik fenotiplere farklılaşması için uyarır. Bu osteoblastlar, osteojenik ortamda kemik matris proteinlerini ve askorbik asidi salgılar ve bu da onları kollajen açısından zengin bir hücre dışı matris oluşturmaya teşvik eder.
Son olarak, osteoblastların hücre içi kalsiyumu ve ortamın fosfatları, ortamda mineralize kristaller oluşturur.
Ortamı çıkarın ve hidroklorik asit çözeltisini ekleyin. Kalsiyum iyonlarını çözelti içinde çözündürmek için inkübe edin. Kalsiyum içeren asidik ortamı çok kuyulu bir plakanın kuyusuna dağıtın.
Kalsiyuma duyarlı bir boya ekleyin ve inkübe edin. Boya molekülleri, asidik ortamdaki kalsiyum iyonlarına bağlanarak mor renkli bir boya-kalsiyum kompleksi oluşturur.
Numunedeki kalsiyum konsantrasyonu ile orantılı olan kompleksin absorbansını ölçün.
Teste başlamadan önce, biyogüvenlik başlığını %70 etanol ile temizleyin ve DMEM ortamını 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Daha sonra, koşul başına 100.000 hücreyi tam DMEM'de 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve 37 santigrat derecede kültürleyin.
24 saat sonra, süpernatan ortamı kalsifiye edici ortamla değiştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede 7 gün boyunca inkübe edin ve üçüncü gün ortamı değiştirin.
7 gün sonra, Arsenazo III reaktifini kullanarak ve absorbansı 650 nanometrede kaydederek 96 oyuklu bir plakadaki kalsiyum konsantrasyonunu ölçün.