JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:57 dk • July 8th, 2025
Zebra balığında, ortamdaki ince partikül madde veya bir hava kirleticisi olan PM, oksidatif strese bağlı kardiyak fonksiyon bozukluğuna neden olur.
PM'nin zebra balığı üzerindeki etkisini incelemek için, zebra balığı embriyolarını, reaktif oksijen türlerinin veya ROS'un oluşumunu tetikleyen PM'den türetilmiş, ekstrakte edilebilir organik maddeye, EOM'ye maruz bırakarak başlayın.
ROS, DNA bazı guanini 8-hidroksi-2-deoksiguanozin veya 8-OHdG'ye oksitler ve histon H2AX'in fosforilasyonunun γH2AX oluşturmasına neden olur - DNA çift iplikli kırılmalar için bir işaretleyici
.Pozlama sonrası, zebra balığı kalbini inceleyin ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. Kalbi, proteinleri çapraz bağlayan ve hücresel yapıyı stabilize eden fiksatif bir çözelti ile tedavi edin.
Ardından, spesifik olmayan bağlanma bölgelerini önlemek için bir engelleme reaktifi ekleyin. Kalp hücrelerinde γH2AX ve 8-OHdG'yi hedefleyen birincil antikorları ekleyin.
Daha sonra, ilgili birincil antikorlarının Fc bölgesine spesifik olarak bağlanan iki farklı renkli floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. Son olarak, örneği, bir floresan kompleksi oluşturmak için DNA'daki AT açısından zengin dizilerin küçük oluğuna bağlanan DNA'ya özgü bir leke olan DAPI ile boyayın.
EOM ile tedavi edilen zebra balığı embriyolarının kalplerindeki 8-OHdG ve γH2AX ekspresyonundan gelen sinyalleri gözlemlemek için slaydı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin.
Kardiyak hücrelerden önemli ölçüde yüksek bir floresan yoğunluğu, EOM'nin neden olduğu oksidatif DNA hasarını ve çift iplikli kırılmaları gösterir.
Temiz bir cam slayt üzerine bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Fiksatif bir çözelti yapmak için 1.25 mikrolitre PBS'ye 50 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Ardından, üç disseke kalbi bir hidrofobik bariyer çemberine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Çözeltiyi mikroskop altında boşaltın ve numuneleri oda sıcaklığında en az 5 dakika kurutun. Slaytları PBST'de yıkama başına 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. % 5'lik bir BSA çözeltisi elde etmek için 1.000 mikrolitre PBST'ye 50 mikrolitre BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için slaytları nemli bir odada 1 saat inkübe edin.
Solüsyonu boşaltın ve numuneleri yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Çalışan bir birincil antikor kokteyli çözeltisi elde etmek için 8-hidroksi-deoksiguanozine karşı iki mikrolitre fare monoklonal antikorunu ve gama-H2AX'e karşı iki mikrolitre tavşan poliklonal antikorunu 296 mikrolitre PBST içinde seyreltin.
Kalp örneklerini 50 mikrolitre birincil antikor kokteyl çözeltisi ile nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında en az 1 saat veya gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Solüsyonu boşaltın ve numuneleri yıkama başına 5 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın. Çalışan bir ikincil antikor kokteyli çözeltisi elde etmek için 1 mikrolitre FITC etiketli keçi anti-fare ikincil antikorunu ve 1 mikrolitre cy3 keçi anti-tavşan ikincil antikorunu 500 mikrolitre PBST içinde seyreltin.
Numuneleri ikincil antikorlarla karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
Solüsyonu boşaltın ve numuneleri yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Nükleer boyama için numunelere 20 mikrolitre DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Slayta bir lamel uygulayın ve kurumasını ve hareket etmesini önlemek için oje ile kapatın.
Numuneleri bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. DMSO kontrol örneklerinin ortalamasını kullanarak göreceli değişiklikleri hesaplayın ve verilerin istatistiksel anlamlılığını belirleyin.