Murin Miyoblastlarının Ko-Kültürdeki Göç Kapasitesini Değerlendirmek için Yara Testi

Bir yaraya yanıt olarak, salgı hücreleri, farklılaşmamış kas hücreleri olan miyoblastları aktive etmek için parakrin sinyal molekülleri üretir. Aktive edilmiş miyoblastlar, çoğaldıkları yara bölgesine doğru göç ederek yaranın iyileşmesine neden olur.

Miyoblastların göç kapasitesini in vitro olarak değerlendirmek için, birleşik bir tek tabaka murin miyoblastları içeren çok kuyulu bir plaka alın. Bir pipet ucu kullanarak, kuyu içinde yara bölgesini simüle eden doğrusal, hücresiz bir yama oluşturmak için tek tabakayı çizin.

Yara yamasını rahatsız etmeden kuyuyu büyüme ortamı ile dikkatlice destekleyin.

Uygun bir ortamda yapışık bir nöral krest hücresi kültürü veya NCC'ler - salgı hücreleri - içeren membranöz bir ek alın. Ek parçayı kuyunun içine yerleştirin, böylece tabandaki NCC'ler yara yamasına yakın olur. Ko-kültürü istenen süre boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, NCC'ler, miyoblastlar üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanan ve bir sinyal kaskadı başlatan sinyal moleküllerini serbest bırakır. Bu sinyalleme, miyoblastlarda aktinin yeniden düzenlenmesini kolaylaştırır ve sonuç olarak, bu hücreler kenarlarında lamellipodia ve filopodia gibi sitoplazmik çıkıntılar geliştirir. Bu çıkıntılar, miyoblastların yaralı bölgeye doğru göç etmesine ve yavaş yavaş yeniden çoğalmasına yardımcı olarak yara iyileşmesine yol açar.

Plakayı bir mikroskop altına yerleştirin ve kapsamı ko-kültürdeki miyoblastların göç kapasitesi ile ilişkili olan yara iyileşmesini gözlemleyin.

Hücreler %70 ila %80 birleşime ulaştığında, süpernatan ortamı C2C12 odasından iyice çıkarın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.

PBS'yi çıkardıktan sonra, steril bir P10 pipet ucunu, hücre tek tabakasının tüm uzunluğunu veya genişliğini kapsayacak şekilde tek bir yönde sıkıca geçirerek hücreleri çizmeye başlayın. Hücreler çizildikten sonra, hızlı bir şekilde 1 mililitre PBS ekleyin.

Sonra, bilgisayarı ve mikroskobu açın. Oda sürgüsünü sahne alanına yerleştirin ve objektif kadranını 5X büyütmeye çevirin. Görüntüleme yazılımını açın, "Kamera" sekmesine tıklayın ve ardından "AxioCam IC" sekmesindeki hücreleri görselleştirmek için "Canlı" düğmesine tıklayın.

Işığın kameraya ve bilgisayar ekranına geçmesine izin vermek için ışık filtresinin tamamen dışarı çekildiğinden emin olun. Yara alanını "AxioCam IC" sekmesindeki canlı görüntünün merkezine yerleştirmek için hazne sürgüsünü manuel olarak hareket ettirin veya döndürün. Görüntü çekmek için, görüntüyü içeren "AxioCam IC" sekmesinin yanında bir "Yeni" sekmesi açmak için "Tuttur"a tıklayın.

Bu hareketsiz görüntüyü kaydetmek için "Dosya"ya tıklayın, "Farklı Kaydet"i seçin, dosyayı masaüstüne kaydetmek için soldaki çubuktan "Masaüstü"nü seçin. Dosya adı kutusuna "Dosya adı"nı girin ve şekli ".czi" dosya biçiminde kaydedin.

Resmi ".tiff" olarak kaydetmek için "Dosya"yı tıklayın, "Farklı Kaydet"i seçin, dosya adı kutusuna "Dosya adı"nı girin, "Tür Olarak Kaydet" düğmesini tıklayın ve açılır menüden "*.tiff" seçeneğini seçin.

Aynı kuyucuktaki yaranın diğer noktalarında iki ila üç görüntü daha çekmek için hazne sürgüsünü manuel olarak yeniden konumlandırın. Görüntülemeden sonra, PBS'yi her bir oyuktan çıkarın ve 1 mililitre C2C12 ortamı ekleyin.

O9-1 hücrelerini içeren ekleri hazne kuyusunun her bir oyuğuna manuel olarak yerleştirerek iyi yerleştirilmiş ko-kültür sistemini monte edin. Ekleri, alt kısmı alttaki C2C12 hücrelerinin hemen üzerine oturacak şekilde nazikçe kuyuya doğru itin. İyi yerleştirilmiş yapıları inkübatöre geri koyun ve hücrelerin toplam 9 ila 12 saat boyunca göç etmesine izin verin.

En uygun göç süresini belirlemek için, hücreleri yara oluşumunu takip eden altı saatte, ardından bundan sonra her iki ila üç saatte bir kontrol edin. Kontrol koşullarındaki hücreler yarayı tamamen kapladığında deneyi sonlandırın.