$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, antijenler, dendritik hücrelerin yüzeyinde bulunan endositik reseptörlere veya antijenlerin alımına yardımcı olan DC'lere (antijen sunan hücreler) özgü antikorlara bağlanır.
Bir antikor-antijen kompleksinin oluşumu çok önemli bir adımdır ve antijenin DC hedefli bir monoklonal antikora kimyasal olarak bağlanmasıyla in vitro olarak gerçekleştirilebilir.
Konjugasyon işleminin verimliliğini doğrulamak için, yakalanan antikorlarla önceden kaplanmış bir ELISA plakası ile başlayın. Antijenlerin kaplanmış yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için plakayı bir bloke edici çözelti ile muamele edin.
Plakaya kimyasal olarak çapraz bağlanmış, antikor-antijen konjugatları ekleyin ve inkübe edin. Antijenin spesifik epitopu, yakalanan antikorun paratopu ile etkileşime girerek bir antikor-antijen-antikor kompleksi oluşturur.
Daha sonra, plakayı bir enzime bağlı üçüncü bir antikor seti ile kaplayın. Bu antikorlar, konjugatta bulunan birincil antikorlara spesifik olarak bağlanarak tespit edilmesini sağlar.
Konjugatları görselleştirmek için kromojenik substratı içeren bir tampon ekleyin. Antikora bağlı enzim, substrat ile reaksiyona girerek renkli ürünü oluşturur.
Plakaya, enzimi inaktive eden ve reaksiyonu sonlandıran asitleştirilmiş bir inaktivasyon çözeltisi uygulayın. Plakayı spektrofotometrik olarak analiz edin. Renkli bir çözeltinin varlığı, antikor-antijen konjugatlarının varlığını doğrular ve başarılı konjugasyonu doğrular.
ELISA ile konjugasyonun başarısını doğrulamak için, uygun bir 96 oyuklu ELISA plakasını oyuk başına 100 mikrolitre anti-OVA antikoru ile kaplayın ve mililitre başına 6 mikrogramdan mililitre başına 93.8 nanograma kadar seyreltmeler elde etmek için anti-DEC-205 / OVA'yı bloke edici tamponda 1: 2 oranında seri olarak seyreltin.
Oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için antikor kaplı plakanın uygun kuyucuklarına her seyreltmeden 100 mikrolitre ekleyin. Kuluçka süresinin sonunda, oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için plakaya anti-DEC-205 / OVA konjugatına karşı 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz konjuge antikoru ekleyin.
Daha sonra, spektrofotometri ile renk reaksiyonunun analizine izin vermek için her oyuğa 50 mikrolitre yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin.