Hücrelerde DNA Hasarı Tespiti için Comet Deneyi

Zararlı ajanlara maruz kalmak, hücresel DNA'da tek ve çift sarmallı kırılmalara neden olur ve bu da DNA hasarına yol açar.

DNA hasarını tespit etmek için, sıvılaştırılmış, düşük erime noktalı agarozda kimyasal olarak işlenmiş hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonu ile başlayın. Süspansiyonu bir cam slayt üzerine yükleyin ve agarozun katılaşmasına izin verin - gözenekli jel matrisi içindeki hücrelerin hareketsiz hale getirilmesini sağlar.

Hücreleri lizis tamponu ile tedavi edin. Tampondaki deterjanlar, hücresel ve nükleer zarları çözündürürken, tuzlar histonları DNA'dan uzaklaştırır ve nükleer matrise bağlı DNA içeren bir nükleoid gövde oluşturur.

Slaytları bir alkalin elektroforez tamponunda inkübe edin. Bu, DNA'nın gevşemesine ve tek sarmallı parçalar oluşturmasına neden olur. Sürgüyü bir elektroforez aparatına yerleştirin ve güç kaynağına bağlayın. Bu, negatif yüklü DNA'nın pozitif anoda doğru göçüne izin verir.

Hasar görmemiş DNA, nükleoid cisim içinde sınırlı kalır. Buna karşılık, daha küçük, hasar görmüş DNA parçaları anoda doğru hareket etmeye başlar. Bu diferansiyel hareket, hasar görmemiş DNA'nın kafayı oluşturduğu, hasarlı DNA'nın ise kuyruklu yıldızın kuyruğunu oluşturduğu kuyruklu yıldız benzeri bir yapı oluşturur.

Tek sarmallı DNA parçalarının yeniden doğasına izin vermek için slaydı bir nötralizasyon tamponunda inkübe edin. Ardından, slayta DNA'yı lekeleyen bir floresan boya uygulayın. Slaytı bir floresan mikroskobu altında görselleştirin.

Kuyruğun yoğunluğu ve uzunluğu, hücresel DNA hasarının derecesi ile ilişkilidir.

Başlamak için, PBS'de% 0.6 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Önceden kaplanmış slaytların buzlu ucunu kalıcı bir işaretleyici veya kurşun kalem kullanarak ad, tarih ve tedavi bilgileriyle etiketleyin.

Düz bir tezgahın üzerine bir soğutma plakası yerleştirin ve metal yüzeyin altındaki sürgülü çekmeceye iki donmuş soğutma paketi yerleştirin. Ardından, 1 ila 2 dakika önceden soğutmak için slaytları soğutma plakasına yerleştirin. Süpernatanı numune tüplerinden santrifüjleyin ve çıkarın ve hemen tekrar buzun üzerine yerleştirin. Hücre peletini 200 mikrolitre %0,6 düşük erime noktalı agaroz ile yeniden süspanse edin ve pipetleyerek karıştırın.

Daha sonra, soğutulmuş bir slayt üzerine 80 mikrolitre agaroz içeren hücre ekleyin ve jelin üzerine hızlı bir şekilde bir lamel yerleştirin. Jelin soğutma plakasında 1 ila 2 dakika sertleşmesine izin verin. Bu arada, 500 mililitre çalışma çözeltisi lizis tamponu hazırlayın ve lizis kabına dökün.

Jeller sertleştikten sonra, lameti başparmak ve işaret parmağı arasında nazikçe tutarak ve lameli jelden kaydırarak lamelleri hızlı bir şekilde çıkarın. Ardından, slaytları, slaytlardaki tüm siyah nokta işaretleri aynı yöne bakacak şekilde bir slayt taşıyıcısının içine yerleştirin. Sürgü taşıyıcıyı lizis kabının içine yerleştirin. Lizis kabının kapağını kapatın ve inkübasyon için koyun.

Jelleri rahatsız etmeden sürgü taşıyıcıyı lizis kabından dikkatlice çıkarın. Sürgü taşıyıcıyı nazikçe, buz gibi soğuk çift damıtılmış su ile önceden yüklenmiş bir yıkama kabına yerleştirin. Slaytların tamamen suya batırıldığından emin olun ve kurulumu 30 dakika bırakın.

Optimum tampon sıcaklığını korumak için elektroforez tankının altına donmuş bir soğutma paketi yerleştirin. Ardından, tanka buz gibi soğuk elektroforez çalışma solüsyonu ekleyin ve kayar taşıyıcıyı içine aktarın. Slaytları, jel içeren hücre katoda bakacak şekilde yönlendirin.

DNA'nın gevşemesine izin vermek için slaytları elektroforez tankında 20 dakika inkübe edin. Ardından, santimetre başına 1,19 voltta 20 dakika boyunca elektroforez yapmak için güç kaynağını açın. Elektroforez tamamlandıktan sonra, güç kaynağını kapatın ve kayar taşıyıcıyı elektroforez tankından çıkarın. Sürgülü taşıyıcının 30 saniye boyunca kağıt mendil üzerinde boşalmasına izin verin.

Ardından, sürgü taşıyıcıyı nötralizasyon tamponu içeren bir kaba yerleştirin ve 20 dakika bekletin. Bunu takiben, buz gibi soğuk çift damıtılmış su içeren bir yıkama kabına koyun ve 20 dakika bekletin. Yıkadıktan sonra, slayt taşıyıcıyı sudan çıkarın ve slaytların 1 saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde kurumasını bekleyin.

Slaytları yeniden sulandırmak için, slayt taşıyıcıyı buz gibi soğuk çift damıtılmış su içeren bir yıkama kabına aktarın ve 30 dakika bekletin. Ardından, slayt taşıyıcıyı mililitre propidyum iyodür çözeltisi başına 2,5 mikrogram içeren bir boyama kabına yerleştirin.

Boyama kabının kapağını kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, slayt taşıyıcıyı ayrı bir kaba aktarın ve 20 dakika boyunca buz gibi çift damıtılmış suyla yıkayın.

Sürgü taşıyıcıyı tabaktan çıkarın ve karanlıkta, 37 santigrat derece inkübatörde veya oda sıcaklığında tamamen kurutun. Slaytlar tamamen kuruduktan sonra, görüntü analizi için hazır olana kadar karanlıkta bir slayt kutusunda saklayın.