JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:04 dk • July 8th, 2025
Amino asit taşıyıcıları, hücre zarları boyunca amino asit transferine aracılık eden ve hayati hücresel süreçleri düzenleyen zara bağlı proteinlerdir.
Amino asit alımını in vitro olarak incelemek için, fare kemik iliğinden türetilmiş stromal hücrelerin bir kültürünü alın. Büyüme ortamını aspire edin. Radyoaktif hidrojen ile etiketlenmiş bir amino asit olan glutamin ile desteklenmiş önceden ısıtılmış bir tampon ekleyin. İstenilen süre boyunca kuluçkaya yatırın.
Önceden ısıtılmış tampon, glutaminin hücresel alımı için gerekli olan fizyolojik sıcaklığı ve uygun bir pH'ı sağlar. Glutamin taşıyıcıları, sodyum iyonu bağlı ko-taşıma yoluyla substrat translokasyonundan sorumlu olan taşıma alanlarından ve membran bağlantılı iskele alanlarından oluşur.
Taşıma alanı, tampondan gelen sodyum iyonları ile birlikte radyoaktif işaretli glutamine bağlanır. Bağlandıktan sonra molekülleri sitoplazmaya bırakır. Eşzamanlı olarak, taşıma alanı, hücre içi sodyum iyonlarını ve nötr amino asitleri hücre dışına taşır ve bu da hücresel homeostaz ile sonuçlanır.
Hücreleri buz gibi soğuk tamponla yıkayın, reaksiyonu sonlandırın ve hücre dışı radyoaktif işaretli glutamini çıkarın. Bir deterjan çözeltisi ekleyin. Deterjan hücreleri parçalayarak hücre içi radyoaktif işaretli glutamin salınımına neden olur.
Lizatı santrifüjleyin. Glutamin içeren süpernatanı bir sintilasyon kokteyli ile bir şişeye ekleyin ve şişeyi bir sintilasyon sayacının içine yerleştirin.
Radyoaktif işaretli glutamin molekülleri, yüksek enerjili beta parçacıkları yayar. Kokteyldeki sintilatörler parçacıkları emer ve sintilasyon sayacı tarafından algılanan ışık darbeleri yayar.
Hücresel glutamin alımını tahmin etmek için radyoaktiviteyi ölçün.
Amino asit alım tahliline başlamak için, FBS, penisilin ve streptomisin ile takviye edilmiş alfa-MEM ortamında 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunda 5 x10 4 ST2 hücresini plakalayın. Normalizasyonlar için koşul başına hücre sayısını ölçmek için fazladan hücre kuyuları oluşturun.
Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe% 5 karbondioksit ile birleşene kadar iki ila üç gün boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri pH 7.4'te bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Ardından, hücreleri bir kez yıkamadan önce PBS'yi bir mililitre Krebs Ringers HEPES veya KRH ile aspire edin.
Hücreleri, mililitre L- [3,4-3 H] -Glutamin çalışma ortamı başına dört mikroküri içeren 0.5 mililitre taze hazırlanmış KRH ile beş dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sonrası, sıvı atık kabına dağıtmak için radyoaktif ortamı toplayın. Daha sonra, reaksiyonu sonlandırmak için hücreleri buz gibi soğuk KRH ile üç kez yıkayın.
Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre% 1 sodyum dodesil sülfat ekleyin ve hücreleri parçalamak ve homojenize etmek için karışımı 10 kez ezin. Daha sonra, hücre lizatlarını 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve lizatı 10 dakika boyunca minimum 10.000 g hızında santrifüjleyerek berraklaştırın.
Süpernatanı, sekiz mililitre sintilasyon çözeltisi içeren bir parıldama şişesine aktarın ve bir sintilasyon sayacı kullanarak dakikada sayım olarak radyoaktiviteyi okuyun.
Kalan radyoaktif olmayan hücre plakalarından, parçalanmış radyoaktif kültürlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için hücreleri tripsize edin, yeniden süspanse edin ve sayın. Bir hemositometre kullanarak, her deneysel koşul için radyoaktif olmayan kuyu başına hücre sayısını sayın.