JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 2:29 dk • July 8th, 2025
Enerji üreten biyokimyasal yollarda önemli bir ara madde olan piruvatın hücresel seviyeleri, enzim bazlı kolorimetrik testler kullanılarak tahmin edilebilir.
Parazitik olmayan bir nematod olan Caenorhabditis elegans hücrelerindeki piruvat seviyelerini belirlemek için, piruvat içeren yetişkin solucanlardan hazırlanan bir hücresel fraksiyon alın. Çözeltiyi tedavi edin, hücresel proteinleri çıkarın ve piruvat içeren arıtılmış hücresel fraksiyonu - test numunesi - toplayın. Hücresel proteinlerin yokluğu, piruvat seviyelerinin doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar.
Piruvat oksidaz ve yaban turpu peroksidaz enzimlerini içeren çalışan bir reaktif ve kromojenik bir boya ekleyerek başlayın. Karışımı karanlıkta yeterli bir süre inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, piruvat oksidaz, substratı olan piruvat ile reaksiyona girer ve bir yan ürün olarak hidrojen peroksit üretir. Işığın olmaması, hidrojen peroksitin kendiliğinden ayrışmasını önler.
Yaban turpu peroksidaz, hidrojen peroksit ile kromojenik boya arasındaki reaksiyonu katalize ederek renkli bir ürün üretir. Renkli reaksiyon ürününün yoğunluğu, numunedeki piruvat konsantrasyonu ile doğru orantılıdır.
Kuluçka süresinin tamamlanmasının ardından, numuneyi bir plaka okuyucunun içine yerleştirin ve emilimini ölçün. Bilinen piruvat konsantrasyonları ile seri bir seyreltme kullanarak standart bir eğri oluşturun.
Test numunesindeki piruvat konsantrasyonunu belirlemek için test numunesinin ölçülen absorbans değerini eğri üzerinde çizin.
Test numunelerindeki piruvat konsantrasyonunu ölçmek için bir kolorimetrik tahlil kiti kullanın ve çift yönlü incelemeler yapın.
96 oyuklu bir plakanın farklı oyuklarına 10 mikrolitre test numunesi ekleyin ve her numuneye 90 mikrolitre çalışma reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kapalı olarak inkübe edin. Ardından, her bir oyuğun emilimini 570 nanometrede ölçmek için plakayı bir mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.
Piruvat standart eğrisini çizin ve her konsantrasyonu 2.25 ile çarparak standart eğriden piruvat konsantrasyonlarını hesaplayın.
Bu makale, enzim tabanlı kolorimetrik analizler kullanarak Caenorhabditis elegans'taki hücresel piruvat seviyelerini tahmin etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Süreç, bir hücresel fraksiyonun hazırlanmasını, proteinleri uzaklaştırmak için uygulanacak işlemi ve piruvat konsantrasyonunu belirlemek için absorbans ölçümünü içerir.
Hücresel fraksiyonlarda piruvatın kantitatif ölçümü, preklinik model sistemlerinde hassas metabolik profilleme sağlar. Bu kolorimetrik analiz, metabolik ara ürünler hakkında güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlayarak erken keşif ekiplerini destekler, hedef doğrulamaya ve yolak analizine ışık tutar. Hassas piruvat kantifikasyonu, translasyonel araştırma portföylerindeki metabolik yolak modülasyonu için öngörü güvenilirliğini artırır.
Bu kolorimetrik pirüvat analizi, hem erken hipotez testlerini hem de metabolik hedeflerin alt akış doğrulamalarını destekleyerek, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026