JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:00 dk • July 8th, 2025
Glikojen sentezinde çok önemli bir enzim olan glikojen sentaz, üridin difosfat glikozu veya UDP-glukozu - bir nükleotid şekeri - UDP ve glikosil kalıntısına ayırır ve salınan glikoz monomerini büyüyen glikojen zincirine ekler.
Glikojen sentaz aktivitesini tahmin etmek için, bir tüpte glikojen, UDP-glikoz, ATP, fosfoenolpiruvat ve nikotinamid adenin dinükleotid veya NADH içeren bir reaksiyon karışımı alarak başlayın. Nükleosit difosfat veya NDP, kinaz enzimi ve bir piruvat kinaz ve laktat dehidrojenaz enzim kokteyli ekleyin. İçeriği karıştırın ve inkübe edin.
Enzimatik reaksiyonu başlatmak için tüpe glikojen sentaz içeren numune ekleyin.
Glikojen sentaz, UDP-glikoz üzerinde etki ederek UDP ve bir glikosil kalıntısı oluşturur. Enzim, serbest glikoz monomerini alır ve onu reaksiyon karışımının glikojen zincirine dahil eder. ATP'nin varlığında, reaksiyon karışımının NDP kinazı, kullanılmayan UDP'yi fosforile eder, onu UTP'ye dönüştürür ve ADP üretir.
Piruvat kinaz enzimi, ADP'ye etki eder ve ATP ve piruvat üretmek için reaksiyon karışımının fosfoenolpiruvat tarafından bağışlanan bir fosfat ekler. Daha sonra, laktat dehidrojenaz, piruvatı laktata dönüştürür ve reaksiyon sırasında NADH'yi oksitler.
Başarılı enzim aktivitesini gösteren tüketilen NADH miktarını ölçmek için 340 nm'de NADH absorbansındaki azalmayı ölçün.
Glikojen sentaz aktivitesinin belirlenmesine başlamak için, önceden hazırlanmış UDP-glikoz, ATP, fosfoenolpiruvat ve NDP kinaz stok çözeltilerini buz üzerinde çözün. Bir su banyosunu 30 santigrat dereceye ısıtın.
Stok çözeltileri hazır olduğunda, metin protokolünde açıklandığı gibi reaktifleri 15 mililitrelik bir tüpe ekleyerek, glikojen sentaz tahlillerinin sayısına göre yeterli tahlil karışımı hazırlayın.
Reaksiyon karışımından NADH'yi suyla değiştirerek boş bir reaksiyon hazırlayın ve reaksiyonu tek kullanımlık bir metakrilat küvetine aktarın. Spektrofotometrede 340 nanometre dalga boyunda 'Sıfır' ayarlamak için boş reaksiyonu kullanın.
1.5 mililitrelik bir tüpte reaksiyon karışımından 770 mikrolitrelik bir alikot alın ve sırayla tüpe 2 mikrolitre NDP kinaz ve piruvat kinaz / laktat dehidrojenaz karışımı ekleyin.
Yavaşça karıştırdıktan sonra, reaksiyon karışımını önceden ısıtmak için tüpü su banyosunda 30 santigrat derecede 3 dakika inkübe edin. Daha sonra, glikojen sentaz içeren numuneden 30 mikrolitreyi pH 7.8'de 20 milimolar Tris tamponuna ekleyin ve reaksiyon karışımını tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarmadan önce hafifçe karıştırın.
Küveti spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı 10 ila 20 dakika boyunca zamanlanmış aralıklarla 340 nanometrede kaydedin. Ardından, zamana karşı elde edilen absorbansları çizin.