JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:52 dk • July 8th, 2025
Gerçek zamanlı hücre analizi, RTCA kullanarak hücre davranışının sürekli ölçümü için, kuyu tabanına gömülü empedans ölçen altın mikroelektrot dizileri içeren bir RTCA mikrotitre plakası elde edin. Kuyucuklara dikkatlice hücre kültürü ortamı ekleyin.
Elektriksel olarak iletken ortam içinde, mikroelektrotlar boyunca zayıf bir elektrik potansiyeli uygulayın. Potansiyel, elektrik akımının mikroelektrotlar arasında akmasına neden olarak, ortamın doğal elektrik direnci olan temel empedansın ölçümünü kolaylaştırır.
İstenilen memeli hücre süspansiyonu konsantrasyonlarını orta içeren kuyucuklara pipetleyin. Hücrelerin kuyu içinde eşit şekilde dağılmasına izin verin.
İnkübasyon sırasında hücreler kuyu dibine yapışır. Mikroelektrotlar üzerindeki yapışkan hücreler, akım akışını kısıtlayan ve empedansı artıran bir yalıtkan görevi görür.
Yavaş yavaş, hücreler mikroelektrotlar üzerinde çoğalır ve üstel empedansın artmasına neden olur.
Birleşen hücre tabakası oluşumunu takiben, hücreler besin yoksunluğu ile karşılaşır ve ölüme uğrar. Sonuç olarak, hücreler mikroelektrotlardan ayrılarak empedansı azaltır.
Sürekli empedans ölçümü, hücre proliferasyonu ve ölümü dahil olmak üzere hücresel olayların gerçek zamanlı izlenmesini kolaylaştırır.
Hücre enfeksiyonu için uygun hücre miktarını belirlemek için, hücreleri PBS ile yıkamadan önce gösterildiği gibi 24 saatlik, yaklaşık% 80 birleşik MDCK hücre kültürleri hazırlayın ve bunları 37 santigrat derecede şişe başına% 0.25 tripsin-EDTA 3 mililitre 45 dakikalık bir inkübasyon ile hasat edin.
Hücreler ayrıldığında, şişe başına 7 mililitre taze kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun ve her kültürden hücreleri sayın. Hücreleri, mililitre hücre kültürü ortamı başına 4 x 105 hücreye seyreltin ve belirtildiği gibi hücrelerin iki kat seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
E-plakanın elektrotlarına dokunmadan her bir oyuğa 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı eklemeden önce birkaç dakika oda sıcaklığında bir E-plaka yerleştirin. Kızakların kilidini açın ve plakanın ön ucunu empedans ölçüm cihazının beşik cebine yerleştirin. Kuluçka makinesinin kapısını kapatın ve yazılımı açın.
"Varsayılan deneme modeli kurulumu"nda, seçili kızakları vurgulayın ve denemenin adını girmek için üst sayfayı çift tıklayın. "Düzen" e tıklayın ve plakanın seçilen her bir kuyucuğu için gerekli numune bilgilerini girin. "Planla" | "Adımlar" | ve "Adım ekle"yi tıklayın. Yazılım, arka plan empedansını ölçmek için otomatik olarak 1 saniyelik bir adım ekleyecektir.
"Yürüt" ve "Başlat / Devam Et" i tıklayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce arka plan empedansının negatif 0.1 ile 0.1 arasında olduğunu onaylayarak uygun kuyuları seçmek için "Çizim" ve "Ekle"ye tıklayın.
Daha sonra, plakayı beşikten çıkarın ve her bir hücre süspansiyonundan 100 mikrolitreyi uygun kuyucuklara iki kopya halinde ekleyin. E-plakayı beşik cebine yüklemeden önce, hücrelerin kuyucukların tabanlarına eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için E-plakasını oda sıcaklığında 30 dakika laminer akış başlığında bırakın. "Planla" ve "Adım Ekle" yi tıklayın ve "Başlat / Devam Et" i seçmeden önce hücreleri her 30 tekrar için her 200 dakikada bir izlemek için değerler girin.
Hücre empedansı verilerini kontrol etmek ve çizmek için, viral enfeksiyon sırasında hala büyüme aşamasında olan hücreleri elde etmek için, tohumlamadan 24 saat sonra durağan fazdan hemen önceki hücre konsantrasyonunu seçin.
Bu makale, gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) kullanılarak hücre davranışının sürekli ölçümü için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu teknik, hücre proliferasyonunu ve ölümünü değerlendirmek için hücre kültürlerindeki empedans değişikliklerinin izlenmesini içerir.
Gerçek zamanlı empedans izleme, hücresel dinamiklerin sürekli ve etiketsiz değerlendirilmesine olanak tanıyarak, erken evre hedef doğrulaması için proliferasyon vele sitotoksisite hakkında öngörülü bilgiler sağlar. Bu yaklaşım, ön aday belirleme ve preklinik iş akışlarındaki karar süreçlerini (go/no-go) bilgilendiren kantitatif ve tekrarlanabilir veriler sunarak mekanistik risk azaltımını destekler. Yöntem, kaynak yoğun alt uygulamalardan önce hastalıklara özgü sistemlerdeki biyolojik belirsizlikleri azaltarak portföy ilişkiliyleliğini artırır.
Gerçek zamanlı empedans izleme, erken hedef doğrulamasından öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, her aşamada veri odaklı karar verme sürecini destekleyen hücresel olayların kinetik çözünürlüğünü sunar.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 22 Ağustos 2026