İnfluenza Virüsünün Enfeksiyon Çeşitliliğini Ölçmek için Empedans Bazlı Hücresel Test

İnfluenza virüsü enfeksiyonu sırasında, virüs hücreye endositoz yoluyla girer ve konakçı hücre mekanizmasını ele geçirerek döl viryonları üretir. Bunlar serbest bırakılır, komşu hücreleri enfekte eder ve bir enfeksiyon çağlayanına neden olur.

Kültürdeki enfeksiyöz influenza virüsünün hücre oranını ölçmek için - enfeksiyonun çokluğu - bir mikrotitre plakasına uygun bir yoğunlukta taze elde edilmiş memeli hücresi süspansiyonu ekleyin.

Plaka, kuyu tabanına gömülü empedans ölçen altın mikroelektrotlar içerir. İnkübe edin, hücrelerin kuyu dibine yapışmasına ve enfeksiyondan önce üstel büyüme aşamasına ulaşmasına izin verin.

Mikroelektrotlar arasına küçük bir elektrik potansiyeli uygulayın. Mikroelektrotlara yapışan hücreler yalıtkan görevi görür, akım akışını kısıtlar ve ölçülen elektrik direncini - empedansı arttırır.

Ortamı çıkarın. İnfluenza virüsü süspansiyonunu kuyucuklara pipetleyin. Uygun bir serin endoproteaz ile takviye edin.

İnkübasyon sırasında, serin endoproteaz, viral glikoprotein hemaglutinin'i parçalar ve aktive eder, bu da spesifik konakçı hücre reseptörlerine bağlanmasını ve ardından virüs hücresi girişini kolaylaştırır.

Konak hücre makineleri kullanılarak, komşu hücreleri enfekte eden yeni viral parçacıklar üretilir ve salınır. Sonuç olarak, virüsle enfekte olmuş hücreler morfolojik değişikliklere uğrar ve sitopatik etkiler gösterir, bu da hücre ölümüne yol açar - hücreler mikroelektrot yüzeyinden ayrılır ve zamanla empedansı azaltır.

Virüs eklenmeden önce empedansın ilk empedansın yarısına düşmesi için geçen süreyi belirleyin. Daha kısa bir zaman dilimi, daha yüksek bir viral enfeksiyon çeşitliliğini gösterir.

CIT₅₀ değerleri ile enfeksiyonun çokluğu arasındaki korelasyonu belirlemek için, 3 x 10⁴ yeni bölünmüş MDCK hücresini 24 saat boyunca elektronik mikrotitre plakasının her bir duvarına kültürledikten sonra, hücreleri iki kez yıkayın 100 mikrolitre taze virüs yayılma ortamı yıkama başına ve her oyuğa 100 mikrolitre viral süspansiyon eklemek için tek kanallı bir pipet kullanın.

Tüm virüs seyreltmeleri eklendiğinde, plakayı 35 santigrat derecede cihazın beşik cebine yavaşça yükleyin ve gösterildiği gibi en az 100 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre empedansını izlemeye başlayın.

İki ölçüm döngüsünden sonra, cihazı "Duraklatmak" için tıklayın ve E-plakayı kızaktan çıkarın. Her oyuğa TPCK-tripsin ile takviye edilmiş 100 mikrolitre virüs yayılma ortamı ekleyin ve E-plaka plakasını beşik cebine geri koyun. Ardından analize başlayın.