İnsan Serumunda Oksidatif Stresi Değerlendirmek için Tiyobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Testi

Hücreler metabolik süreçler sırasında düşük seviyelerde serbest radikal üretir.

Patolojik durumlarda, serbest radikal aşırı üretimi meydana gelir ve oksidatif strese neden olur. Bu serbest radikaller, lipid peroksidasyonu adı verilen bir süreçte hücresel zar fosfolipidlerindeki çoklu doymamış yağ asitlerine saldırır. Bu, zar hasarına ve hücre ölümüne neden olan lipid hidroperoksitler ve malondialdehit (MDA) dahil olmak üzere toksik oksidasyon ürünleri oluşturur.

İnsan serumundaki oksidatif stresi tespit etmek için in vitro tiyobarbitürik asit reaktif madde (TBARS) testi kullanılarak, oksidasyona neden olan bir bileşik ile muamele edilmiş insan serumu içeren bir tüp ile başlayın. Tedavi edilen serum, fosfolipidler, lipitler ve proteinler ile birlikte büyük ölçüde lipid peroksidasyon ürünlerini (MDA ve lipid hidroperoksitler) içerir.

Daha sonra, sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin ve lipitleri çözündürmek ve MDA'yı serbest bırakmak için karıştırın. SDS, kirletici proteinleri denatüre eder. Uygun bir asidik tampon ve ardından asidik tiyobarbitürik asit (TBA) ekleyin. Yüksek sıcaklıkta inkübe edin.

Asidik koşullar ve yüksek sıcaklıklar altında, TBA molekülleri MDA ile reaksiyona girer ve TBARS adı verilen stabil bir kırmızı-pembe MDA-TBA kompleksi oluşturur. Reaksiyonu durdurmak ve mevcut kompleksleri stabilize etmek için buz üzerinde inkübe edin.

merkezkaç. MDA-TBA içeren süpernatanı toplayın ve çok kuyulu bir plakaya aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, kompleksin emilimini ölçün.

Daha yüksek bir absorbans, serumda daha yüksek seviyelerde lipid peroksidasyon ürünleri ve oksidatif stresi gösteren yüksek bir TBARS konsantrasyonunu gösterir.

Analiz edilecek numuneler için cam tüpleri etiketleyin, ardından hazırlanan numuneden her tüpe 100 mikrolitre ekleyin. Her numuneye 200 mikrolitre %8,1 SDS ekleyin ve karıştırmak için cam tüpü dairesel hareketlerle hafifçe döndürün.

Her numuneye 1,5 mililitre 3,5 molar sodyum asetat tamponu ekleyin. Daha sonra 1.5 mililitre sulu% 0.8 tiyobarbitürik asit çözeltisi ekleyin. 700 mikrolitre deiyonize su ekleyerek her tüpteki son hacmi 4 mililitreye getirin. Cam tüpleri sıkıca kapatın ve 1 saat boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Yoğuşmayı önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün. Daha sonra tüpleri bloktan çıkarın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneleri ve standartları 1.500 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Her tüpten 150 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve hava kabarcıklarını bir pipet ucuyla temizleyin.

Numunelerin absorbansını 532 nanometrede ölçün. Ardından, boş numunelerin ortalama absorbans okumasını diğer tüm absorbans okumalarından çıkarın.

Standart bir eğri oluşturun ve bunu bilinmeyen numune konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanın.