Fitoöstrojen Östrojenik Aktiviteyi Taramak için Östrojen Reseptör-Raportör Aktivite Testi

Östrojenler, endokrin sinyal molekülleri olarak işlev gören ve nükleer reseptörlere bağlanan steroid hormonlarıdır - östrojen reseptörleri beta, östrojen-beta reseptör kompleksleri oluşturur.

Bu ligand-reseptör kompleksleri hücre sitoplazmasında dimerize olur ve homodimerler oluşturur. Elde edilen homodimer çekirdeğe girer, östrojen yanıt elemanına, ERE'ye (hedef genin promotörü içindeki spesifik bir DNA dizisi) bağlanır ve transkripsiyonu başlatır.

Fitoöstrojenlerin östrojenik aktivitesini belirlemek için - östrojen fonksiyonunu taklit eden bitki kaynaklı ikincil metabolitler - uygun bir ortamda süspanse edilmiş raportör hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.

Raportör hücreler, östrojen reseptörleri beta'yı aşırı eksprese etmek için tasarlanmıştır ve ERE promotörüne kaynaşmış bir lusiferaz geni ile transfekte edilir. Fitoöstrojen içeren örnek çözeltiyi ekleyin ve inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, fitoöstrojen, raportör hücrelerde eksprese edilen östrojen reseptörlerine, beta'ya bağlanır. Bağlandıktan sonra, fitoöstrojen reseptör kompleksleri dimerize olur ve çekirdeğe yer değiştirir.

Çekirdeğin içinde, dimerize kompleks ERE'ye bağlanır. Bağlanma, lusiferaz gen transkripsiyonunu başlatarak lusiferaz enzimini üretir. Daha sonra, ortamı çıkarın ve lusiferaz için bir substrat içeren bir reaktif ekleyin. İfade edilen lusiferaz enziminin substratını oksitlemesine ve lüminesans üretmesine izin vermek için inkübe edin.

Numunedeki bileşiğin östrojenik aktivitesini doğrulayan lüminesansı ölçün.

Örnekleri girdaplayın. Daha sonra,% 0.8'lik bir DMSO çözeltisi elde etmek için 496 mikrolitre bileşik tarama ortamına her numuneden 4 mikrolitre ekleyin.

Önceden ısıtılmış bir hücre geri kazanım ortamı tüpünün dış yüzeyini %70 etanol ile dezenfekte edin ve 10 mililitre ortamı çözmek için donmuş raportör hücrelerden oluşan bir tüpe aktarın. Raportör hücrelerin tüpünü kapatın ve 5 ila 10 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin.

Hücreleri su banyosundan aldıktan sonra, hücre agregalarını parçalamak ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. Ardından, tüpün yüzeyini %70 etanol ile temizleyin.

100 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 96 mikrolitre raportör hücre süspansiyonu dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Ardından, 100 mikrolitre numuneyi uygun kuyucuklara üç nüsha halinde dağıtın. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 22 ila 24 saat inkübe edin.

Plaka inkübasyonunun bitiminden hemen önce, algılama alt tabakasını ve algılama tamponunu buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenene kadar düşük ışıklı bir alana yerleştirin. Ardından, çözeltileri karıştırmak için her bir tüpü yavaşça ters çevirin.

Plaka inkübasyonu tamamlanmadan hemen önce, lusiferaz tespit reaktifi oluşturmak için algılama tamponunun tüm içeriğini algılama substratı tüpüne dökün. Köpük oluşmaması için tüpü hafifçe karıştırın.

Numune plakasının içeriğini uygun bir atık kabına atın ve kuyucuklardaki son damlacıkları çıkarmak için temiz, emici bir kağıt havluya hafifçe vurun. Her oyuğa 100 mikrolitre lusiferaz tespit reaktifi ekleyin ve tahlil plakasının oda sıcaklığında 15 dakika dinlenmesine izin verin. Ardından, 96 oyuklu plaka okuma luminometresi kullanarak lüminesansı ölçün.