Hücrelerde protein fosforilasyonunun izlenmesi için zamana bağlı Forster rezonans enerji transferi
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 5:13 dk. • July 8th, 2025
Bazı hücresel proteinlerin fosforilasyonu, aktivasyonlarına veya deaktivasyonlarına yol açan önemli bir düzenleyici mekanizmadır.
Spesifik protein fosforilasyonunu izlemek için, yapışık hücreler içeren bir kültür plakası alın. Hücrelerdeki proteinlerin fosforilasyonunu teşvik etmek için hücreleri bir stimülatör ile tedavi edin. Harcanan ortamı aspire edin ve bir hücre lizis tamponu ve bir fosfataz inhibitör kokteyli ekleyin.
Tampon bileşenleri, fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş proteinlerle birlikte hücresel içeriği serbest bırakarak hücre lizizine neden olur. İnhibitör kokteyli, hücresel fosfatazı inaktive eder, böylece fosforile proteinler bozulmadan kalır.
Hücre lizatını düşük hacimli bir algılama plakasına aktarın. Lizatı, ışığa duyarlı farklı floroforlara bağlı donör ve alıcı antikorlarla tedavi edin.
İnkübasyon sırasında, donör antikorlar, test proteini üzerindeki spesifik bir epitopu tanır ve proteinin fosforile edilmiş ve fosforile edilmemiş varyantlarını bağlamalarına izin verir. Buna karşılık, alıcı antikorlar sadece test proteininin fosforile formuna bağlanır.
Bu bağlanma, alıcı floroforu, fosforile protein varyantlarında donör floroforun yanına getirir. Bu yakınl
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin