Test Bileşiklerinin Nöronlar Üzerindeki Nörotoksisitesini Değerlendirmek için Lüminesans Tabanlı Test

Nörit büyümesi - nöronların projeksiyonlar geliştirdiği yer - nöral fonksiyon ve rejenerasyon için çok önemlidir.

Nörit büyümesini teşvik eden test bileşiklerinin nörotoksik etkilerini in vitro olarak değerlendirmek için, farklılaşma ortamında bir insan nöral progenitör hücresi, hNPC, süspansiyon elde edin.

Hücreleri, poli-L-lizin ve laminin ile kaplanmış çok kuyulu plaka kuyucuklarına tohumlayın, hücrenin kuyu dibine bağlanmasını kolaylaştırır ve hücresel büyümeyi destekler. Farklılaşma ortamı bileşenleri, nöronlara hNPC farklılaşmasını teşvik eder.

Bir kuyu setini nörit büyümesini teşvik eden test bileşiği ile muamele edin. Bu, hNPC'den türetilen nöronlarla etkileşime girer ve hücresel metabolik süreçleri ve ardından birincil hücresel enerji kaynağı olan adenozin trifosfat, ATP konsantrasyonunu bozmadan nörit büyümesine neden olabilir.

Magnezyum iyonları ile birlikte deterjanlar, lusiferaz enzimi ve lusiferaz substratı, lusiferin ve ATPaz inhibitörleri içeren tek aşamalı reaktifi ekleyin ve karıştırın.

Deterjanlar hücre zarını bozarak hücre parçalanmasına ve hücre içi ATP'nin çözeltiye salınmasına neden olur. ATPaz inhibitörleri, salınan endojen ATPazı inhibe eder ve bu da ATP ölçümüne müdahale edebilir. Santrifüj, tortu hücresi kalıntıları.

İnkübasyon sırasında, magnezyum iyonları ile salınan ATP, lusiferinin lusiferaza bağlanmasına neden olur, bu da lusiferinin yüksek derecede uyarılmış oksilusiferine oksidasyonuna neden olur ve temel durumuna gevşetildiğinde biyolüminesan bir foton yayar. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, ATP konsantrasyonunun göstergesi olan lüminesansı ölçün.

Daha yüksek ATP konsantrasyonu, daha yüksek hücre canlılığını temsil eder, bu da nöronlar üzerinde önemli bir test bileşiği toksisitesini önermez.

Plakayı kaplamak için, 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 30 mikrolitre poli-L-lizin ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. PBS ile iki kez yıkayın ve yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin.

Her oyuğa 30 mikrolitre laminin ekleyin, ardından plakayı 2 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yıkamaları PBS ile tekrarlayın ve hücreleri kaplamaya devam edin. 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 25 mikrolitre farklılaşma ortamında 20.000 tek hücreli nöroküre ekleyin ve plakayı 5 gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Tek hücrelere ayrılan nörokürelerin tam sayısını kaplamak için yüksek hassasiyetli pipetleme becerileri gereklidir. Bu nedenle, daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kaplamadan önce nörosferleri nöronlara ayırmak önerilir.

İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa istenen konsantrasyonun 6 katı kadar 5 mikrolitre test bileşiği ekleyin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin.

Hücre canlılığı testini gerçekleştirmek için, her bir oyuğa 30 mikrolitre ışıldayan reaktif ekleyin ve plakayı 2 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde bırakın. Plakayı 30 saniye boyunca 300 ila 400 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, plakayı ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bir mikroplaka okuyucusundaki lüminesansı ölçün.