Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

Protein-protein etkileşimleri hayati hücresel fonksiyonlar için çok önemlidir.

Transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için - hücre zarının lipid çift tabakasını kapsayan zar proteinleri, yapışık bir memeli hücre kültürü içeren çok kuyulu bir plakanın kuyuları ile başlayın.

Daha sonra, uygun bir transfeksiyon ajanı ve bir çift ekspresyon plazmidi içeren bir çözelti ekleyin.

İfade plazmitlerinden biri, lusiferaz enziminin işlevsel olmayan küçük fragmanına kaynaşmış bir transmembran proteinini kodlar; diğer plazmit, lusiferaz enziminin büyük işlevsel olmayan fragmanına kaynaşmış ikinci bir transmembran proteinini kodlar.

Plakayı inkübe edin. Transfeksiyon ajanı, ekspresyon plazmitlerinin hücresel alımını kolaylaştırır.

Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, transmembran proteinleri eksprese eder. İfade edilen transmembran proteinler arasındaki etkileşim, sitoplazmaya bakan küçük ve büyük fragmanları birbirine yaklaştırarak bağlanmalarına ve aktif lusiferaz enzimini oluşturmalarına neden olur.

Arka plan parlaklığını en aza indirmek için kuyucuklardaki ortamı serumsuz ortamla değiştirin. Hücre geçirgen bir lusiferaz substratı olan furimazin - çözeltisi ekl