Spesifik Protein-Protein Etkileşimlerini Tanımlamak için Bölünmüş Lusiferaz Tamamlama Testi

0 views • 4:02 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein-protein etkileşimleri hayati hücresel fonksiyonlar için çok önemlidir.

Transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için - hücre zarının lipid çift tabakasını kapsayan zar proteinleri, yapışık bir memeli hücre kültürü içeren çok kuyulu bir plakanın kuyuları ile başlayın.

Daha sonra, uygun bir transfeksiyon ajanı ve bir çift ekspresyon plazmidi içeren bir çözelti ekleyin.

İfade plazmitlerinden biri, lusiferaz enziminin işlevsel olmayan küçük fragmanına kaynaşmış bir transmembran proteinini kodlar; diğer plazmit, lusiferaz enziminin büyük işlevsel olmayan fragmanına kaynaşmış ikinci bir transmembran proteinini kodlar.

Plakayı inkübe edin. Transfeksiyon ajanı, ekspresyon plazmitlerinin hücresel alımını kolaylaştırır.

Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, transmembran proteinleri eksprese eder. İfade edilen transmembran proteinler arasındaki etkileşim, sitoplazmaya bakan küçük ve büyük fragmanları birbirine yaklaştırarak bağlanmalarına ve aktif lusiferaz enzimini oluşturmalarına neden olur.

Arka plan parlaklığını en aza indirmek için kuyucuklardaki ortamı serumsuz ortamla değiştirin. Hücre geçirgen bir lusiferaz substratı olan furimazin - çözeltisi ekleyin. Furimazin hücrelere girer, ardından lusiferaz furimazini oksitleyerek yüksek yoğunluklu lüminesans oluşturur.

Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, transmembran proteinler arasındaki güçlü etkileşimi düşündüren lüminesansı ölçün.

Yapışık HEK293T hücre kültürünü tripsinizasyon ile hasat edin ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri şeffaf bir alt, beyaz taraf, 96 oyuklu bir plaka üzerine yerleştirin. Kopyalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonları ve kontrolleri barındırmak için toplam kuyu sayısını ayarlayın. Daha sonra, hücreleri standart koşullarda gece boyunca kültürleyin.

Ertesi gün, hücreleri istenen ekspresyon plazmit kombinasyonları ile transfekte edin. Plazmitleri serum içermeyen bir ortamda her yapı için mikrolitre başına 6.25 nanograma seyreltin ve lipid bazlı transfeksiyon reaktifini uygun bir lipit-DNA oranında ekleyin.

Plazmitleri üreticinin talimatına göre inkübe edin. Daha sonra, belirlenen kuyucuklara 8 mikrolitre lipit-DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini hafif rotasyonla karıştırın ve hücreleri standart koşullarda 20 ila 24 saat boyunca kültürleyin.

Ertesi gün, her bir oyuktaki şartlandırılmış ortamı 100 mikrolitre serum içermeyen bir ortamla değiştirin ve hücrelerin ortam değişiminde ayrılmadığından emin olun.

Lüminesansı ölçmeden hemen önce, bir hacim furimazini 19 hacim seyreltme tamponu ile karıştırın. Her bir oyuğa 25 mikrolitre furimazin çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı elle veya bir orbital çalkalayıcı ile hafifçe karıştırın.

Plakayı bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna yerleştirin ve plakayı 37 santigrat derecede 10 ila 15 dakika dengeleyin. Analiz edilecek kuyuları seçin ve 0,3 saniyelik bir entegrasyon süresiyle lüminesansı okuyun. Gerektiğinde lüminesansı iki saate kadar izlemeye devam edin.

10:20

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Related Videos

0 Views

05:51

CRISPR Plazmidlerinin Yapımı ve Çift Luciferase Muhabir Sistemi Ile Memeli Hücrelerinde Nakavt Etkinliğinin Saptanması

Related Videos

0 Views

07:31

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Related Videos

0 Views

04:29

Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

Related Videos

0 Views

10:13

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Related Videos

0 Views

11:46

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Related Videos

0 Views

12:53

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Related Videos

0 Views

08:38

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Related Videos

0 Views

07:55

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Related Videos

0 Views

06:45

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026