$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Protein-protein etkileşimleri hayati hücresel fonksiyonlar için çok önemlidir.
Transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri incelemek için - hücre zarının lipid çift tabakasını kapsayan zar proteinleri, yapışık bir memeli hücre kültürü içeren çok kuyulu bir plakanın kuyuları ile başlayın.
Daha sonra, uygun bir transfeksiyon ajanı ve bir çift ekspresyon plazmidi içeren bir çözelti ekleyin.
İfade plazmitlerinden biri, lusiferaz enziminin işlevsel olmayan küçük fragmanına kaynaşmış bir transmembran proteinini kodlar; diğer plazmit, lusiferaz enziminin büyük işlevsel olmayan fragmanına kaynaşmış ikinci bir transmembran proteinini kodlar.
Plakayı inkübe edin. Transfeksiyon ajanı, ekspresyon plazmitlerinin hücresel alımını kolaylaştırır.
Başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, transmembran proteinleri eksprese eder. İfade edilen transmembran proteinler arasındaki etkileşim, sitoplazmaya bakan küçük ve büyük fragmanları birbirine yaklaştırarak bağlanmalarına ve aktif lusiferaz enzimini oluşturmalarına neden olur.
Arka plan parlaklığını en aza indirmek için kuyucuklardaki ortamı serumsuz ortamla değiştirin. Hücre geçirgen bir lusiferaz substratı olan furimazin - çözeltisi ekleyin. Furimazin hücrelere girer, ardından lusiferaz furimazini oksitleyerek yüksek yoğunluklu lüminesans oluşturur.
Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, transmembran proteinler arasındaki güçlü etkileşimi düşündüren lüminesansı ölçün.
Yapışık HEK293T hücre kültürünü tripsinizasyon ile hasat edin ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri şeffaf bir alt, beyaz taraf, 96 oyuklu bir plaka üzerine yerleştirin. Kopyalar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonları ve kontrolleri barındırmak için toplam kuyu sayısını ayarlayın. Daha sonra, hücreleri standart koşullarda gece boyunca kültürleyin.
Ertesi gün, hücreleri istenen ekspresyon plazmit kombinasyonları ile transfekte edin. Plazmitleri serum içermeyen bir ortamda her yapı için mikrolitre başına 6.25 nanograma seyreltin ve lipid bazlı transfeksiyon reaktifini uygun bir lipit-DNA oranında ekleyin.
Plazmitleri üreticinin talimatına göre inkübe edin. Daha sonra, belirlenen kuyucuklara 8 mikrolitre lipit-DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini hafif rotasyonla karıştırın ve hücreleri standart koşullarda 20 ila 24 saat boyunca kültürleyin.
Ertesi gün, her bir oyuktaki şartlandırılmış ortamı 100 mikrolitre serum içermeyen bir ortamla değiştirin ve hücrelerin ortam değişiminde ayrılmadığından emin olun.
Lüminesansı ölçmeden hemen önce, bir hacim furimazini 19 hacim seyreltme tamponu ile karıştırın. Her bir oyuğa 25 mikrolitre furimazin çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı elle veya bir orbital çalkalayıcı ile hafifçe karıştırın.
Plakayı bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna yerleştirin ve plakayı 37 santigrat derecede 10 ila 15 dakika dengeleyin. Analiz edilecek kuyuları seçin ve 0,3 saniyelik bir entegrasyon süresiyle lüminesansı okuyun. Gerektiğinde lüminesansı iki saate kadar izlemeye devam edin.