Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Dubleks dijital polimeraz zincir reaksiyonu — ddPCR — iki farklı genetik belirteçin aynı anda kantitatif olarak saptanmasına izin verir.

Başlamak için, iki farklı hedef dizisi içeren bir örnek alın. Termostabil bir DNA polimeraz enzimi, dNTP'ler ve hedefe özgü primerler içeren bir karışım ekleyin. Ardından, güçlendirilmiş hedefleri tespit etmek için floresan raportörler ve bir söndürücü molekül ile etiketlenmiş iki farklı hedefe özgü oligonükleotid probu ekleyin.

Çözelti, hedef dizileri çok sayıda nanodamlacığa bölmek için yağ ile emülsifiye edilir. Hedefi içeren her damlacık, ayrı bir reaksiyon kabı görevi görür.

Tek tek nanodamlacıkların içindeki amplifikasyon reaksiyonu için termal döngü sürecini başlatın.

Yüksek bir denatürasyon sıcaklığında, çift sarmallı hedefler tek sarmallara ayrılır.

Uygun tavlama sıcaklığına ulaşmak için sıcaklığı düşürün, astarların ve oligonükleotid problarının şablona bağlanmasına izin verin.

Söndürücünün yakınlığı, muhabirin floresansını bastırır. Uzatma sıcaklığında, DNA polimeraz primerleri uzatır ve oligonükleotid probunu parçalar. İlişkisiz muhabir floresan yayar.

Damlacıkları bir floresan algılama sistemi olan bir damlacık okuyucusundan geçirin. Tek veya çift floresansın algılanması, hedefleri içeren pozitif damlacıkları gösterirken, bir sinyalin olmaması negatif damlacıkları gösterir.

Pozitif damlacıkların toplam bölüm sayısına oranı, hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu belirler.

Bu prosedüre başlamak için, önce, protokol metninde açıklandığı gibi, moleküler dereceli sudaki tüm primerler ve TE pH 8 tamponundaki problar için litre başına 100 mikromol stok konsantrasyonu hazırlayın. Ardından, uygun miktarlarda dijital PCR karışımı, ileri ve geri primerleri, floresan probu ve nükleaz içermeyen suyu karıştırarak bir ana karışım hazırlayın. Karıştırmak için en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin, ancak solüsyona hava kabarcıkları girmemesine dikkat edin.

dPCR ana karışımı, geleneksel qPCR ana karışımından daha viskoz olduğundan, homojen bir çözelti oluşturmak için pipetleme tekniği ile karıştırmayı kullanmak gerekir. Bu, aşağı yönde doğru dPCR miktar tayinine izin verir.

Numuneleri çift olarak çalıştırmak için damlacık üretimi için tahlil karışımını yapmak için, ana karışımın 36 mikrolitresini normal bir PCR plakasına pipetleyin. 36 mikrolitrelik ana karışımların her birine, 12 mikrolitre DNA şablonunu karıştırın ve karşılık gelen kopya kuyucuklarını plaka üzerinde boş bırakın. Testin düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontroller ekleyin. Plaka içinde kontaminasyon olmadığından emin olmak ve daha sonra veri analizi için floresan taban çizgisini ayarlamak için Hiçbir Şablon Kontrolü veya NTC Dahil Etmeyin.

Damlacık üretecini kurmadan önce, karışımları yaklaşık 15 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için çok kanallı bir pipet kullanarak tahlil karışımlarını karıştırın. Karışımda fazla kabarcık oluşmasını önlemek için pipet ucunun sıvının içinde kaldığından emin olun.

Ardından, sekiz kuyu içeren birinci kartuşu beyaz bir kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş tutucuyu tıklayarak kapatın. Birinci kartuş artık sıkıca yerine oturmuştur ve damlacıklar oluştururken tutucudan çıkarılamaz.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, tahlil karışımından 20 mikrolitreyi, hava kabarcıkları oluşturmadan 'Örnek' olarak işaretlenmiş kartuşun orta konumuna nazikçe aktarın. 70 mikrolitre damlacık oluşturma yağını 'Yağ' olarak işaretlenmiş kartuşun sol tarafına pipetleyin.

Kartuşu bir contayla kapatın, contanın düz olduğundan ve kartuşun kenarına doğru dört kene tarafından eşit şekilde tutulduğundan emin olun. Kapıyı açmak ve kartuşu yerleştirmek için damlacık üreteci üzerindeki yeşil ışıklı düğmeye basın. Jeneratörü kapatmak için düğmeye tekrar basın. Kapı kapandıktan sonra yeşil düğme kararır ve kapı tekrar açılamaz.

Damlacık oluşumu hemen başlayacak ve yaklaşık 1 dakika devam edecektir.

Damlacık üretimi devam ederken, kartuş iki'yi ikinci bir beyaz kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş bir'le aynı şekilde hazırlayın. Damlacık oluşumu tamamlandığında, loş ışıklı düğme yeşile dönecektir.

Damlacık jeneratörü kapağını açın. Kartuş birini içeren beyaz kartuş tutucuyu çıkarın ve bir kenara koyun. Kartuş ikisini damlacık üretecine yerleştirin.

Contayı birinci kartuştan çıkarın ve atın. Eylem yeni oluşan damlacıkları kırabileceğinden, beyaz kartuş tutucunun işaretini çıkarmayın.

40 mikrolitreye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, uçları 45 derecelik bir açıyla işaretlenmiş damlacıkların üçüncü sütununa yerleştirin ve tüm damlacıkları yavaşça pipetleyin. Pipet ucunu kuyu duvarına yaklaşık yarıya kadar koyarak ve damlacığı yavaşça dışarı atarak bunları son PCR plakasına aktarın.

Aynı şekilde, kartuş iki için damlacık üretimi tamamlandığında, contayı kartuş ikiden çıkarın ve üretilen damlacıkları son PCR plakasına aktarın. Plakanın üzerine delinebilir bir folyo kapak yerleştirin ve bir plaka kapatıcıya yerleştirin. Kapatıcıyı 180 santigrat dereceye ayarlayın. Kapatıcıdaki "Oynat" düğmesine basın ve 10 saniye boyunca kapatın.

Bu prosedüre başlamak için, kapalı son PCR plakasını termal döngüleyiciye yerleştirin. Son PCR plakası ile uyumlu ve saniyede 2 santigrat derece sıcaklık rampa hızına sahip bir termal döngüleyici kullanın.

Aşağıdaki termal programı çalıştırın: 95 santigrat derecede 10 dakika, ardından 94 santigrat derecede 30 saniyelik 40 döngü ve 60 santigrat derecede 60 saniye ve ardından 98 santigrat derecede 10 dakikalık bir tutma. Döngü tamamlandıktan sonra, her bir oyuktaki her damlacıktaki floresansın otomatik ölçümü için plakayı bir damlacık okuyucusuna aktarın.

Damlacık okumaya devam etmeden önce damlacıkların oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Damlacık okumasını ayarlamak için beraberindeki yazılımı açarak başlayın. Boş bir 96 oyuklu plakanın şemasını içeren varsayılan "Kurulum" menüsünde, "Örnek", "Tahlil 1" ve "Tahlil 2" olmak üzere üç bölüm içeren menüyü açmak için A1 kuyusuna çift tıklayın.

Örnek bölümünde, "Ad" etiketli kutuya örnek kimliğini yazın ve sağdaki "Uygula" işaretli kutuyu işaretleyin. Ardından, "Deneme" etiketli açılır menüyü tıklayın. Nadir Olay Tespiti için "KIRMIZI"yı seçin ve 'Enter'a tıklayın.

"A1" olarak gösterilen bölüme geçin. "Ad" bölümünde, testi doldurun ve 'Enter'ı tıklayın. "Tür" etiketli aşağıdaki kutuda, açılır menüyü tıklayın, "Kanal 1 Bilinmeyen" i seçin ve 'Enter'ı tıklayın.

"A2" olarak gösterilen bölüme geçin. "Ad" bölümünde, testi doldurun ve 'Enter'ı tıklayın. "Tür" etiketli aşağıdaki kutuda, açılır menüyü tıklayın, "Kanal 2 Bilinmeyen" i seçin ve 'Enter'ı tıklayın.

Önceki adımlardaki tüm bilgiler artık A1 kuyusunda mevcuttur.

Damlacıklar içeren sonraki tüm kuyuları adlandırın. Toplam kurulum süresinden tasarruf etmek için, aynı anda birden fazla kuyu seçmek için 'Shift' veya 'Control'e tıklayın. Plakanın dijital tasviri fiziksel plakayı yansıttığında, menünün sağ alt kısmındaki "Tamam"a basın. Plaka şemasının üst kısmında görünen yeni menüde, "Şablon" bölümünün altında, "Farklı Kaydet"i seçin ve plakayı adlandırın ve kaydedin.

Ekranın solunda, "Çalıştır"a tıklayın ve açılan "Çalıştırma Seçenekleri" penceresinde uygun Boya Setini seçin. Veri toplama başlayacak ve yazılımda gerçek zamanlı olarak görüntülenecektir.