Viral enfeksiyonları teşhis etmek için gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR

Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR, viral enfeksiyonları tanımlamak için yararlıdır.

Hedef viral RNA'yı içeren bir örnekle başlayın. Ters transkriptaz enzimi ve dNTP'lerle birlikte hem DNA sentezine hem de amplifikasyona yardımcı olan hedefe özgü primerler ekleyin.

PCR döngüleri boyunca DNA'yı amplifiye etmek için bir enzim olan termostabil DNA polimeraz ve çift sarmallı DNA, dsDNA'ya giren bir boya olan SYBR yeşili ekleyin. Reaksiyonu bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Primerlerin hedef RNA'ya bağlanması için uygun bir sıcaklık ayarlayın.

Ters transkriptaz, primere dNTP'ler eklerken, aynı anda şablon RNA'yı parçalayarak cDNA'yı sentezler.

Ters transkriptazı etkisiz hale getirerek sıcaklığı arttırın. Sıcaklığı düşürün, primerlerin sonraki amplifikasyon için cDNA'ya tavlanmasına izin verin. DNA polimerazın primerleri uzattığı ve dsDNA'yı sentezlediği uzatma adımına ulaşmak için sıcaklığı artırın.

Ardışık döngüler üstel dsDNA amplifikasyonu ile sonuçlanır. SYBR yeşili, DNA'ya artan sayılarda bağlanarak floresan emisyonunda orantılı bir artışa neden olur. Döngüler boyunca algılanan floresan sinyalini çizin.

Pozitif bir amplifikasyon eğrisi, numunede viral RNA'nın varlığını gösterir.

Erime sıcaklığına ulaşmak için sıcaklığı kademeli olarak artırın ve dsDNA'yı tek iplikçikler halinde denatüre edin. Bağlı boya molekülleri serbest bırakılır - floresanlarını kaybeder. Sıcaklığa karşı azalan floresansı çizin.

Virüse özgü erime sıcaklığına karşılık gelen bir zirve, viral enfeksiyonu doğrular.

Hem test hem de kontrol örneklerini dikkate alarak PCR plakanızın yerleşimini bir elektronik tablo ile planlayın. Yüzeyleri dezenfekte ederek bir PCR iş istasyonu hazırlayın ve bir UV kabini kullanıyorsanız, başlamadan 10 dakika önce UV ışığını açın.

Çözmek için reaktifleri ve astarları dondurucudan çıkarın, ancak enzim karışımını her zaman buz üzerinde tutun. Reaktifleri karıştırın ve sıvıyı toplamak için kısa bir süre santrifüjleyin. El yazması talimatlarına göre lyssavirus ve beta-aktin için PCR ana karışımları hazırlayın. Ana karışımları kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde bırakın. Hazırlanan ana karışımları karıştırın ve santrifüjleyin ve 19 mikrolitreyi PCR makinesine uyumlu plaka veya tüp şeridinin ilgili kuyucuklarına dağıtın.

Ayrı bir odada veya bir UV kabininde, hazırlanan RNA'nın 1 mikrolitresini dikkatlice ekleyin. UV kabini kullanıyorsanız, başlamadan 10 dakika önce UV ışığını açın. Test örneklerinden sonra, pozitif denetimi ve şablon yok denetimini ekleyin.

RNA'yı ana karışımlara eklerken, doğru kuyuya eklendiğinden emin olun. Bu adıma yardımcı olması için plaka planını kullanın.

Plakayı kapatın, kapakların plaka boyunca düz olduğunu kontrol edin ve kuyucukların dibindeki tüm sıvıyı toplamak için aşağı doğru döndürün. Her kuyucuğun aynı hacimde sıvıya sahip olduğundan ve kabarcıkların görünmediğinden emin olun. Ardından numuneleri PCR makinesine aktarın.

'Dissociation' ile 'SYBR Green'i seçerek programı açın. Numune türü olarak "Bilinmeyen" ve floresan boya olarak "SYBR" seçerek analiz edilecek kuyucukları seçin. Tahlilin Lyssavirus kuyusu için mi yoksa beta-aktin için mi olduğu da dahil olmak üzere, plaka düzenindeki kuyucukları numune bilgileriyle etiketleyin.

"Termal Profil Kurulumu"na tıklayın ve termal döngü koşullarını el yazmasında belirtildiği gibi değiştirin. "Başlat" ı tıklayın, ardından dosyayı kaydetmek için bir konum seçin ve çalışmanın sonunda lambayı kapatmak için kutuyu işaretleyin. Lamba ısınmasından önce başlatma seçeneği göründüğünde, "Şimdi Çalıştır" ı tıklayın, ancak lambanın ısınması için 15 dakikadan az olduğundan emin olun.