Bakteriyofajları Numaralandırmak için Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:25 dk. • July 8th, 2025
Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, qPCR yoluyla bakteriyofajları numaralandırmak için, optimize edilmiş bir tamponda Taq DNA polimeraz, primerler, deoksinükleotid trifosfatlar - dNTP'ler - ve floresan raportör boya molekülleri içeren bir qPCR reaksiyon kokteyli elde edin. Bir qPCR plakasının kuyularına aktarın.
Isıl işlem görmüş bakteriyofajları ekleyin. Isıl işlem, bakteriyofaj parçacıklarından bakteriyofaj DNA'sını serbest bırakır. Karışımın buharlaşmasını önleyerek plakayı kapatın. Uygun döngü koşullarını ayarlayarak plakayı qPCR sistemine yükleyin.
Yüksek sıcaklıklara ısıtma, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara denatüre eder. Aynı zamanda Taq DNA polimerazı aktive eder. Tavlama, diziye özgü primerlerin tamamlayıcı bakteriyofaj DNA zincirlerine bağlanmasına neden olur. Uzatma, aktive edilmiş Taq DNA polimerazın, primerin 3' ucuna dNTP'ler eklemesine izin vererek, büyüyen DNA zincirini 5' ila 3' yönünde uzatır.
Boya molekülleri, yeni sentezlenen çift sarmallı DNA'ya enterkalik yaparak floresan yoğunluğunun artmasına neden olur. Her PCR döngüsü, floresan yoğunluğunu artırarak hedef DNA miktarını iki katına çıkarır.
Ölçülen floresansın arka plan seviyesini aştığı eşik döngüsün
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin