Tek sarmallı DNA'yı Amplifiye etmek için Mikroküre Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Mikroküre-PCR, yüzeylerindeki oligonükleotidlere bağlı mikro boyutlu bir küre kullanır, bu da tek sarmallı DNA'nın tercihli amplifikasyonunu sağlar.

Mikroküre-PCR'ye başlamak için, şablon tek sarmallı DNA zincirleri, ek bir nükleotid etiketli ileri primerler, termostabil DNA polimeraz, dNTP'ler ve tek sarmallı oligonükleotid problarını gösteren mikroküreler içeren bir reaksiyon karışımı alın.

Tüpü bir termocycler'a yerleştirin ve tanımlanan koşullarda çalıştırın.

İlk döngüde, tavlama sıcaklığında, şablon DNA, mikrokürenin yüzeyindeki proba bağlanır, böylece şablon DNA, duyu ipliği olarak işlev görür. Uzatma sırasında, polimeraz DNA'yı uzatır ve dubleks mikroküreye bağlı kalır.

Bir sonraki döngüde, denatürasyon sırasında, şablon DNA mikroküreden ayrılır ve prob zincirini yüzeye bağlı bırakır - yeni bir iplik için bir şablon görevi görür.

Tavlama sırasında, etiketli astar antisens ipliğe bağlanır. Daha sonra polimeraz, nükleotid etiketi ile duyu zincirini sentezlemek için onu genişletir.

Çift sarmallı kirleticiler bağlı kalırken, çözeltiye giren tek sarmallı DNA'nın birden fazla kopyasını oluşturmak için döngüyü birkaç kez tekrarlayın.

PCR ürünlerini bir yükleme tamponu içeren bir tüpe aktarın. Ürünü ve işaretleyicileri jelin farklı kuyucuklarına yükleyin ve agaroz jel elektroforezi kullanarak ayırın.

Şablon DNA'lar soluk düşük moleküler ağırlıklı bir bant oluştururken, yoğun yüksek moleküler ağırlıklı bir bant, tek sarmallı DNA amplifikasyonunu doğrular.

40X büyütmeli bir ışık mikroskobu kullanarak mikroskobik sayım yoluyla yaklaşık 25 mikro küre elde edin. Bunu takiben, tüm reaktifleri metin protokolünde açıklandığı gibi birleştirin. Numuneleri bir termocycler'a yerleştirin ve uygun koşullar altında asimetrik PCR'yi başlatın.

Simetrik bir PCR'den sonra süpernatant toplanması en kritik adımlardan biridir çünkü mikroküreler ile tek sarmallı DNA üretmek için önemli bir süreçtir.

Amplifikasyonu takiben, her numuneye sekiz mikrolitre 6X yükleme tamponu ekleyin. Her numuneden 15 mikrolitre% 2 agaroz jel içine yükleyin. Ardından, 1X TAE tamponunda 35 dakika boyunca 100 voltta elektroforez gerçekleştirin.