$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Yüksek çözünürlüklü erime polimeraz zincir reaksiyonu, HRM-PCR, çift sarmallı DNA, dsDNA dizi varyasyonlarını yüksek hassasiyetle tespit eder.
Aktif olmayan Taq polimeraz, deoksiribonükleotid trifosfatlar - dNTP'ler - ve floresan raportör boyası içeren bir ana karışımla başlayın. İleri ve geri astarları ekleyin. Karışımı bir PCR plakasının kuyularına pipetleyin.
dsDNA şablonunu ekleyin. Karışımın buharlaşmasını önleyerek plakayı kapatın. PCR'ye başlayın.
Yüksek denatüre etme sıcaklığı, dsDNA'yı tek sarmallı DNA'ya, ssDNA'ya denatüre eder ve polimerazı aktive eder. Reaksiyon daha sonra tavlama sıcaklığına soğutulur ve bölgeye özgü tamamlayıcı baz eşleştirmesi yoluyla ssDNA'lara ileri ve geri primer bağlanmasını kolaylaştırır.
Aktive edilmiş polimeraz işe alınır ve DNA-primer dupleksini dNTP ilavesi ile genişletir.
Doymuş konsantrasyonlarda bulunan dsDNA'ya özgü bir boya olan floresan raportör boyası, tüm dubleks içinde iç içe geçerek parlak bir şekilde floresan verir. Dubleks, birden fazla PCR döngüsüne tabi tutulur ve birkaç varyant içeren fragman üretir.
PCR sonrası, reaksiyon sıcaklığını zaman içinde sabit bir şekilde yeniden yükselterek erime eğrisi analizi yapın.
Nükleotid dizisine bağlı olarak, varyant içeren bölge önce denatüre olabilir ve boyayı serbest bırakabilir. Kalan boya bağlama bölgeleri doygun hale geldikçe, boya yeniden interkalatlanamaz ve floresan yoğunluğunu azaltır. Ayrıca, dsDNA, artımlı ısıtma üzerine ssDNA'ya ayrışır.
dsDNA'nın yarısının keskin bir floresan düşüşü ile ssDNA'ya denatüre olduğu erime sıcaklığını tanımlayın. Amplifiye edilmiş DNA fragmanlarının erime eğrisindeki bir kayma, numunenin nükleotid dizisi varyasyonlarını tanımlar.
HRM-PCR protokolünü gerçekleştirmek için önce DNA örneklerini 1.5 mililitrelik tüplerde su ile mikrolitre başına 10 nanogram konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, çözülmüş astar çözeltilerini 1.5 mililitrelik tüplerde suyla aynı 6 mikromolar konsantrasyona kadar seyreltin. HRM-PCR kit solüsyonlarını çözün ve tüm içeriğin geri kazanılmasını sağlamak için girdap yaparak dikkatlice karıştırın.
DNA bağlayıcı boya, magnezyum klorür ve su ile enzimatik karışım içeren üç şişeyi açmadan önce bir mikrosantrifüjde kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 1,5 mililitrelik bir tüpte, metin protokolünde açıklandığı gibi PCR karışımını 120 mikrolitrelik reaksiyona hazırlamak için bileşenleri kullanın. Girdap yaparak dikkatlice karıştırın.
Moleküler biyolojideki iyi uygulamalara göre dikkatle, navigasyonla çalışmanız çok önemlidir.
19 mikrolitre PCR karışımını beyaz çok kuyulu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin. Konsantrasyon ayarlı DNA şablonundan 1 mikrolitre ekleyin, ardından beyaz çok kuyulu plakayı sızdırmazlık folyosu ile kapatın. Beyaz çok kuyulu plakayı, uygun adaptörlere sahip çok kuyulu plakalar için bir rotor içeren standart bir döner kovalı santrifüjde 1500 kez g'de 1 dakika santrifüjleyin. Beyaz çok kuyulu plakayı HRM-PCR cihazına yükleyin. HRM-PCR programını metin protokolünde bulunan PCR koşullarıyla başlatın.
HRM-PCR reaksiyonunu takiben, metin protokolünde açıklandığı gibi CR1 uzunluk polimorfizmini belirlemek için HRM analizi yapın.