JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:28 dk • July 8th, 2025
DNA sitozin kalıntısı metilasyonu, lökositlerin veya beyaz kan hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir.
Multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu veya mdPCR, lökositler içindeki çoklu metillenmiş DNA bölgelerinin aynı anda tanımlanmasına izin verir.
Reaksiyon tamponu, DNA polimeraz ve nükleaz içermeyen su içeren bir karışım hazırlayın. Her hedef bölge için özel ileri ve geri primerler ve floresan hidroliz probları ekleyin. Problar, floresan emisyonunu engellemek için söndürücülere bağlı farklı renkli florofor raportörleri içerir.
Bisülfite dönüştürülmüş DNA ekleyin, burada metillenmemiş sitozinler urasillere deamine edilirken metillenmiş sitozinler değişmeden kalır. Karışım.
Bir cam şırıngayı bir taşıyıcı yağ-yüzey aktif madde karışımı ve diğerini bir taşıyıcı yağ-PCR karışımı ile doldurun ve bunları mikroakışkan damlacık jeneratörüne bağlayın. Taşıyıcı yağ-sulu PCR karışımı, nanolitre altı boyutlu damlacıklar halinde emülsifiye olur. Yüzey aktif madde emülsiyonu stabilize eder ve damlacık birleşmesini önler.
Damlacıkları toplayın ve PCR gerçekleştirin. Her damlacık içinde, yüksek denatüre edici sıcaklık, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallı DNA'ya denatüre eder ve polimerazı aktive eder. Reaksiyon sıcaklığı düşürülür, bu da astarların ve probların sahaya özgü tavlanmasına izin verir.
Polimeraz, DNA-primer dupleksini bağlayıp uzattıkça, urasiller timinler olarak çoğalırken, metillenmiş sitozinler sitozinler olarak çoğalır ve metillenmiş ve metillenmemiş bölgelerin ayrımına izin verir. Polimeraz ayrıca raportörü probdan ayırır ve serbest bırakır, bu da floresan emisyonuna neden olur.
PCR sonrası, damlaları mikroskop altında görselleştirin. Floresan rengi, spesifik metillenmiş DNA hedeflerinin varlığını gösterir.
Damlacık üretimi için, 1 mikrolitre bisülfit dönüştürülmüş DNA'yı bir PCR tüpünde yeni hazırlanmış prob ana karışımı ile karıştırın ve numuneyi kısa bir santrifüjleme ile toplayın. Tek kullanımlık akışkan boruyu iki adet 250 mikrolitre hacimli hassas cam şırıngaya bağlamak için PEEK bağlantı parçalarını kullanın ve bir hassas cam şırıngayı %5 floro-yüzey aktif madde içeren 250 mikrolitre taşıyıcı yağ ve 50 mikrolitre taşıyıcı yağ içeren bir hassas cam şırınga ile önceden doldurun.
Her iki şırınga da yüklendiğinde, 100 mikrolitre PCR karışımını taşıyıcı yağ şırıngasına yükleyin ve yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış dik bir ışık mikroskobu sahnesine bir damlacık mikroakışkan cihazı yerleştirin.
Damlacık oluşumunun gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesi ve kaydedilmesi için, önceden doldurulmuş şırıngaları programlanabilir bir şırınga pompasına yerleştirin ve şırıngaların borusunu damlacık mikroakışkan cihazının ilgili giriş kanallarının borularına bağlamak için bağlantı parçalarıyla PEEK rakorunu kullanın.
Boruyu damlacık üretecinin çıkışından 0,5 mililitrelik bir PCR tüpünün içine yerleştirin ve şırınga pompası akış hızını dakikada 2 mikrolitreye ayarlayın. Elde edilen emülsiyonu toplamadan önce damlacık boyutunun stabilize olmasına izin verin. Emülsiyonu tüpün üstünden yavaş ve dikkatli bir şekilde toplayın ve 75 mikrolitre çözeltiyi termal döngü için 200 mikrolitrelik bir PCR tüpüne aktarın.
Ardından, termal döngü sırasında damlacıkların birleşmesini önlemek için PCR tüpündeki yağ içeriğinin dağılmış fazın hacmiyle yakından eşleştiğini onaylayın ve 200 mikrolitrelik tüpü termal döngüleyiciye yerleştirin.