Nanoakışkan bir çip kullanarak nadir transkript varyantlarını tespit etmek için çip tabanlı dijital PCR

Çip tabanlı dijital PCR tekniği, tek bir reaksiyonu nanoakışkan bir çipin odalarına böler. Bölümlenmiş dizilerin amplifikasyonu, nadir transkript varyantlarının - düşük bir frekansta meydana gelen kanonik olmayan transkriptlerin - tespit edilmesini sağlar.

Başlamak için, hedef nadir transkript varyantının ve ortak varyantın cDNA'sını içeren bir örnek alın. Termostabil DNA polimeraz, dNTP'ler ve primerler içeren bir çözelti ekleyin.

Farklı floresan raportörler ve söndürücü molekülleri ile etiketlenmiş yaygın ve nadir transkript varyantına özgü oligonükleotid probları ekleyin. Söndürücü, yakın mesafedeyken muhabirin floresansını emer.

Karışımı nanoakışkan çip üzerine yükleyin. Çözelti, eşit büyüklükte nano odalara bölünür. Bir cDNA içeren her oda, bağımsız bir reaksiyon kabı görevi görür.

Termal döngü işlemini başlatın. Yüksek bir denatüre etme sıcaklığı, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara ayırır. Sıcaklığı düşürün, primerlerin ve oligonükleotid problarının tek DNA zincirleri üzerindeki tamamlayıcı bölgelere tavlanmasına izin verin.

DNA polimerazın astarı uzattığı ve probu parçaladığı uzatma adımına ulaşmak için sıcaklığı artırın. Söndürücüden uzaklık, muhabirin floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyalini okuyun.

Güçlendirilmiş nadir transkript hedefine sahip odaları ve hedeften yoksun odaları gösteren bir dağılım grafiği oluşturun. Hedef için pozitif sinyaller, numunede nadir transkript varyantının varlığını gösterir.

Başlamak için, ana karışımın ve tahlilin oda sıcaklığında en az 20 dakika çözülmesine izin verin. Ardından, 0.5 mililitrelik tüpleri cDNA örneklerinin 6 mikrolitrelik alikotları ile yükleyin. Ayrıca, şablonsuz bir kontrol tüpü yapın. Daha sonra, ana karışımı nazikçe girdaplayın ve reaksiyon başına 8.7 mikrolitreyi steril bir tüpe alikotlayın.

Daha sonra, her reaksiyon için 0.87 mikrolitre özel tahlil astarı ekleyin ve 1.83 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Kombinasyonu yavaşça karıştırın ve cDNA içeren her tüpe 11.4 mikrolitre aktarın ve şablon kontrolüne geçin. Ardından, tüpleri nazikçe karıştırın ve tüp içeriğini nabız santrifüjü kullanarak havuzlayın. En iyi sonuçlar için talaşları mümkün olan en kısa sürede yükleyin.

Talaş yükleyiciyi prize takın ve gösterge ışığı yeşile dönene kadar bekleyin. Ardından, pistonu 1 ila 2 milimetreye hafifçe çekerek daldırma sıvısı şırıngasını hazırlayın, ardından kapağı çıkarın ve ucu ekleyin.

Ardından, yeni bir çipin kapağında yazan kodu not edin, ardından kapağı dikkatlice yandan tutun, koruyucu filmi soyun ve yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde kapak yuvasına yerleştirin. Şimdi, kelepçeyi açmak için kolu aşağı bastırın ve çipi dikkatlice talaş yuvasına yükleyin.

Ardından, yükleyiciye yeni bir yükleme bıçağı yerleştirin. Sıkıca yerine oturduğundan emin olmak için hafifçe itin. Şimdi, 14,5 mikrolitre reaksiyon karışımını yükleme bıçağına aktarın. Hava kabarcığı yapmayın ve bıçağı saptırmayın. Ardından, sesi çip üzerine dağıtmak için siyah "Yükleniyor" düğmesine basın.

Yükleme bıçağının yerinde olduğunu doğrulamak önemlidir. Ardından, bıçağı doldururken, kabarcıkların girmesini önlemek için pipeti ikinci durdurucuya kadar bastırmayın. Ayrıca, bıçağı uçla saptırmayın.

Çip yüzeyine yaklaşık 20 damla daldırma sıvısı aktarmak için şırıngayı kullanarak devam edin. Uç kısmı ile yüzeye temas etmemeye özen gösterin ve yüzeyi taşmadan tamamen kaplayın. Ardından, kapağın çip ile temas etmesini sağlamak için rotor kolunu döndürün ve 15 saniye boyunca aşağı bastırın. Ardından, talaşı serbest bırakmak ve yükleyici kolunu dinlenme konumuna geri döndürmek için kapak düğmesine basın. Şimdi, kelepçeyi açın ve daldırma sıvısını bir şırınga aracılığıyla doldurma portundan dikkatlice dağıtmak için monte edilmiş çipi 45 derecelik bir açıyla tutun. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için çipi hafifçe döndürün ve ardından steril mendille fazla sıvıyı çıkarın.

Ucun kenarına daldırma sıvısı dökmekten kaçının. Böyle bir durumda, sızdırmazlıktan önce fazlalığı dikkatlice çıkarın.

Son olarak, kapaktaki etiketi nazikçe soyarak ve ardından doldurma portunu en az 5 saniye bloke ederek talaş kutusunu kapatın. Şimdi, çipi iki saat içinde kullanın ve o zamana kadar karanlıkta saklayın.

Reaksiyonu ayarlamak için kapağı açın ve tek bir blok kullanılsa bile adaptörleri her iki bloğa da takın. Ardından, numune bloklarının üzerine bir çip yerleştirin ve doldurma portlarını termal döngüleyicinin önüne doğru yönlendirin ve portu hafifçe yükseltin. İki bloğu dengelemek için boş fişler kullanın.

Ardından, talaşları tamamen kaplamak için termal pedi kurulumun üzerine yerleştirin. Ardından döngüleri programlayın, kapağı kapatın ve reaksiyonu başlatın.

Reaksiyon bittiğinde, termal döngüleyiciyi kapatın, termal pedleri çıkarın ve ardından talaşları çıkarın. Cipslerin karanlıkta en az 10 dakika oda sıcaklığında çözülmesine izin verin ve bir saat içinde analiz edin. Talaş yüzeyini sızıntı veya diğer sorunlar açısından incelerken izopropanol ile temizleyin.

Verileri kaydetmek için, verilerin kaydedilebileceği dedektör sistemine bir USB bellek çubuğu yerleştirin. Ardından, dedektör sisteminin çip tepsisini açın ve çipi yüzü yukarı bakacak şekilde yükleyin. Tepsiyi kapatın ve verilerin işlenmesi için 30 saniye bekleyin. Ardından, çipi çıkarın ve bir sonraki çip için işlemi tekrarlayın.

Ardından, USB çubuğunu dedektörden bir bilgisayara taşıyın ve dosyaları aktarın. Bulut tabanlı yazılımı açın, ardından bir proje oluşturun ve ilgilenilen çipler için tüm veri dosyalarını içe aktarın. Ardından, "Tanımlı Cipsler" sekmesi altında, kullanılan boya ve tahlili seçin. Çipin kabul edilebilir olup olmadığını "Verileri İncele" sekmesinde görselleştirerek belirleyin. Numune iyi yüklendiyse, en az 13.000 nokta kullanılabilir olmalıdır.

Ardından, seçilen çip için dağılım grafiğine bakın. Burada, tahlil türü tarafından tanımlanan bir eşik uygulayın. Floresein amid raportör boya sinyali için 6.000 eşiği kullanın. Şimdi, yanlış pozitiflerle sonuçlanabilecek şüpheli sinyalleri kaldırın. "Kement" aracını kullanarak dağılım grafiğindeki şüpheli noktayı seçin ve "Belirlenmemiş" seçeneğini seçin.

Kalan tüm pozitif noktalar, analiz edilen nadir hedefin cDNA kopyalarının varlığını gösterir.