Protein-Protein Etkileşimlerini Tespit Etmek için Grafen Biyosensör Tabanlı Alan Etkili Biyoalgılama

Protein-protein etkileşimleri, PPI'ler, çoğu biyolojik sürecin düzenlenmesinde kritik öneme sahiptir.

Alan etkili biyoalgılama kullanarak PPI'leri tespit etmek için, grafen alan etkili bir transistör çipi ile başlayın. Çip, kaynak ve drenaj elektrotları arasındaki yarı iletken kanal olarak karboksil ile işlevselleştirilmiş bir grafen yüzeyi içerir.

Çipi, bir zwitteriyonik tampon içinde taze bir karbodiimid ve N-hidroksisülfosüksinimid, sülfo-NHS çözeltisi ile inkübe edin. Bu tampon, karbodiimid ve sülfo-NHS'nin çipin işlevselleştirilmiş karboksil gruplarını aktive etmesini ve amin-reaktif esterler oluşturmasını sağlayan uygun bir pH oluşturur.

Hedef protein çözeltisini ekleyin. Birincil aminler, amin reaktif esterlerle reaksiyona girerek, amid bağı oluşumu yoluyla çip üzerindeki proteinleri hareketsiz hale getirir. Bağlanmamış amin-reaktif esterleri bloke etmek için amin içeren söndürme çözeltisi ekleyin, spesifik olmayan bağlanmayı önler.

Çipi elektronik okuyucuya yerleştirin ve bir tamponla kalibre edin. Okuyucu, elektrotlar arasında sabit bir voltaj uygular. Analit-bağlanmamış durumdaki elektrotlar arasında ortaya çıkan elektrik akımı akışı ölçülür.

En düşük analit konsantrasyonunu ekleyin. Analit proteinleri ve çip üzerinde hareketsiz hale getirilen hedefler arasındaki etkileşim, grafen yüzeyinin yerel yük dağılımını değiştirir ve I-yanıtı olarak kaydedilir - elektrotlar arasındaki akım akışındaki değişiklik.

Kayıt sonrası, bağlı analitleri ayırmak için bir tamponla yıkayın. Analizi artan analit konsantrasyonları ile tekrarlayın.

Artan analit konsantrasyonları ile I-yanıtında kademeli bir artış, hedef ve analit arasındaki güçlü PPI'leri gösterir.

Eşit hacimlerde EDC ve sülfo-NHS solüsyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırarak başlayın. Şirket tarafından sağlanan biyosensör çiplerini, kapaklı bir cam Petri kabına yerleştirin. Çip aktivasyonunda yer alan tüm işlevselleştirme adımlarının Petri kabı içinde yapılması önerilmektedir. Biyosensör çipine 50 mikrolitre 1 molar MES tamponu uygulayın. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.

Ardından, tamponu aspire edin ve hemen sensör çipine 50 mikrolitre EDC / sulfo-NHS çözeltisi uygulayın. Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Çipten EDC / sülfo-NHS çözeltisini aspire edin ve 50 mikrolitre 1 molar MES tamponu uygulayın.

MES tamponunu aspire edin ve çipi 50 mikrolitre 1x PBS ile iki kez durulayın. PBS'yi çipten aspire edin ve hedef molekül Hsp90'ı ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, hedef molekülü içeren çözeltiyi aspire edin ve 50 mikrolitre 1x PBS ile üç kez durulayın.

1x PBS solüsyonunu çipten aspire edin ve 50 mikrolitre Quench 1 solüsyonu ekleyin. Cam Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Quench 1 solüsyonunu çipten aspire edin ve 50 mikrolitre Quench 2 solüsyonu ekleyin. Cam Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, Quench 2 çözeltisini çipten aspire edin ve son PBS damlacığını sensörde bırakarak 50 mikrolitre 1X PBS kullanarak çipi beş kez durulayın.

İstenilen konsantrasyon aralığında Cdc37 için analit seyreltme serisini hazırlayın. Güvenilir bir ayrışma sabiti veya KD değeri elde etmek için deneyi en az sekiz farklı analit konsantrasyonu içerecek şekilde tasarlayın ve bu farklı seyreltmeleri kalibrasyon ve hedef protein için kullanılan aynı tamponda hazırlayın.

Çipi dikkatli bir şekilde alete yerleştirin. Yazılımın açık olduğundan ve LED ışığının yeşile döndüğünden emin olun. Ardından, otomatik yazılımdaki "Deneyi Çalıştır" modülüne basın ve "Rejenerasyonlu 10 Puan" veya istediğiniz başka bir protokolü seçin. Operatör adı, deney adı, tarih, rejenerasyon tamponu, hareketsiz hedef ve çözeltideki analit gibi ayrıntıları doldurun. Yazılımda görüntülenen "Deneye Başla" düğmesine basın ve otomatik yazılım tarafından gösterilen talimatları izleyin.

Cihaz kalibrasyonunu gerçekleştirmek için, çipten kalan PBS çözeltisini aspire edin ve 50 mikrolitre kalibrasyon tamponu uygulayın. 'Devam' düğmesine basın ve kalibrasyon adımı bitene kadar beş dakika bekleyin. Yazılım, kalibrasyon adımı için belirlenen bitiş noktasını takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.

Ardından, kalibrasyon tamponunu çipten aspire ederek ve en düşük analit konsantrasyonundan 50 mikrolitre uygulayarak bir analit ilişkilendirmesi gerçekleştirin. 'Devam' düğmesine basın ve ilişkilendirme adımı bitene kadar beş dakika bekleyin. Yazılım, devam etmek için bir uyarı alarmı ile ilişkilendirme adımının bitiş noktasını görüntüler.

Bir analit ayrışması gerçekleştirmek için, analit çözeltisini çipten aspire edin ve 50 mikrolitre ayrışma tamponu uygulayın. 'Devam' düğmesine basın. Ayrışma adımı süresinden sonra, yazılım bir uyarı alarmı ile ayrışma adımının bitiş noktasını görüntüler.

Daha sonra, ayrışma çözeltisini çipten aspire ederek ve 50 mikrolitre rejenerasyon tamponu uygulayarak çip rejenerasyonu gerçekleştirin. Ardından, 'Devam' düğmesine basın. Rejenerasyon adımının tamamlanması genellikle yaklaşık 30 saniye sürer. Bundan sonra yazılım, takip etmek için uyarı alarmı ile rejenerasyon adımının bitiş noktasını görüntüler.

Son olarak, çipi yıkamak için rejenerasyon solüsyonunu çipten aspire edin ve 50 mikrolitre yıkama tamponu uygulayın. Çözeltiyi çipten aspire edin ve bunu beş kez tekrarlayın. Yıkama tamponunun son damlasını çip üzerinde bırakın. Ardından, 'Devam' düğmesine basın ve yazılım ekranında yıkama adımı süresi bitene kadar 30 saniye bekleyin.

Kullanılan her analit konsantrasyonu için adımları tekrarlayın. Kalibrasyon, analit ilişkilendirme, ayrışma, rejenerasyon ve beş kez yıkamanın beş adımı bir döngüyü oluşturur.