Antijen-antikor etkileşimlerini tek molekül düzeyinde incelemek için kütle fotometrisi

Kütle fotometrisi kullanarak antijen-antikor etkileşimlerini tespit etmek için, önce istenen saflaştırılmış antijen ve antikor konsantrasyonunu gerekli süre boyunca inkübe ederek antijen-antikor bağlanmasını kolaylaştırın. Antijen bağlanmasının stokiyometrisine dayanarak, bu antikorların paratop bölgeleri değişen sayıda bağlı antijene sahip olabilir.

Antijen-antikor kompleksleri ile birlikte serbest antikorları içeren çözeltiyi önceden monte edilmiş bir akış odasından geçirin. Odayı bir kütle fotometresinin mikroskop aşamasına sabitleyin. Ardından, optimum görüntüleme için lazer ışınını akış odasından geçirin.

Her bir antikora bağlı antijenlerin sayısına bağlı olarak, komplekslerin moleküler kütlesi değişir. Kütledeki bu değişimler, komplekslerin ışığı farklı şekilde dağıtmasına neden olur.

İki antijenin tek bir antikorun her iki paratopuna da bağlandığı daha yüksek moleküler kütleli kompleksler, tek antijen içeren komplekslere kıyasla daha fazla ışık saçar. Ek olarak, serbest antikorlar en az miktarda ışık saçılımı gösterir.

Bir dedektör saçılan ışığı toplar ve frekansını ve yoğunluğunu ölçer. Fotometre, saçılan ışıktaki dalgalanmaları bir girişim modeli olarak kaydeder ve bunu noktalar olarak temsil eder.

Soluk noktalar serbest antikorlara karşılık gelir. Buna karşılık, çok koyu noktalar iki antijenli kompleksleri temsil eder ve daha az koyu nokta bir bağlı antijen içerir.

Koyu lekelerin varlığı antijen-antikor etkileşimlerine uygundur.

Kütle fotometrisi ile antikor-antijen afinitesini değerlendirmek için, alet hedefine bir damla mikroskop daldırma yağı uygulayın ve akış odasını mikroskobun sahnesine yerleştirin. Akış odası kanalının bir ucuna 10 mikrolitre filtrelenmiş PBS ekleyin. Tampon, kılcal hareket ile kanala girecektir.

Veri toplama yazılımının Odak Kontrolü sekmesinde, ilk ayarlamaları yapmak için kaba sahne hareketi Yukarı ve Aşağı düğmelerini kullanın ve netlik sinyali okumasını görüntülemek için Keskinlik'e tıklayın. Keskinlik değerini en üst düzeye çıkarmak için ince Yukarı ve Aşağı ayar düğmelerini kullanın ve odak izleme işlevini etkinleştirmek için Odağı Ayarla ve Odağı Kilitle'ye tıklayın. Temiz bir slaytın görüntüsü, %0,05'e eşit veya altında bir "sinyal" değerine sahip olmalıdır.

Gösterildiği gibi ilk antikor-antijen örneğinden 20 mikrolitre yükleyin, sıvıyı diğer ucundan küçük bir kurutma kağıdı parçasıyla kurulayın. Yüklemeden hemen sonra, 100 saniyelik veriye eşdeğer uygun sayıda kare elde etmek için Kaydet'e tıklayın. Veri toplama süresinin sonunda, veriler için bir dosya adı girin ve dosyayı kaydetmek için Tamam'a ve ardından Örnekle'ye tıklayın.

Toplu fotometri verilerini analiz etmek için, ilgilendiğiniz dosyayı açın ve Analiz Et'e tıklayın. Kalibrasyon işlevini yüklemek için Yükle'ye tıklayın ve analiz edilen verileri kaydetmek için Dosya ve Sonuçları Farklı Kaydet'e tıklayın.

Numunedeki her bir türün nispi konsantrasyonlarını elde etmek için "eventsFitted.csv" dosyasını açın, M sütunundaki verileri uygun çizim ve analiz yazılımına kopyalayın ve moleküler kütle dağılımını çizmek için Çizim/İstatistik/Histogram işlevini kullanın. Plot Properties (Çizim Özellikleri) penceresini açmak için histograma çift tıklayın, otomatik gruplamayı devre dışı bırakın ve 2,5 kiloDalton'luk bir kutu boyutu seçin.

Depo merkezleri ve sayımları verilerini oluşturmak için, Uygula ve Git'i tıklatın. Histogramı Gauss işlevleriyle uyumlu hale getirmek için, Bölme Merkezleri ve Sayımlar sütunlarını seçin ve Analiz/Tepeler ve Temel/Çoklu Tepe Sığdırma menü işlevlerini tıklatın. Dağılım grafiğindeki yaklaşık tepe konumlarını belirtmek için çift tıklatın ve NLFit'i Aç'ı tıklatın.

"xc" merkezleri için Sabit onay kutularını işaretleyin ve değerlerini serbest antikorun ve tek ve çift antijen-antikor komplekslerinin beklenen moleküler kütlelerine ayarlayın. Genişlik parametreleri için Paylaş seçeneğini işaretleyin ve Sığdır'a tıklayın.

Gauss bileşenlerinin takılan tepe yükseklik değerleri, numunedeki her bir türün nispi konsantrasyonunu temsil eder. Ardından, en yüksek yükseklik değerlerinden her bir türün konsantrasyon fraksiyonunu hesaplamak için denklemi kullanın.