Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu için FLIM-FRET Görüntüleme

Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak canlı bakterilerde spesifik protein-protein etkileşimlerini incelemek için, Förster rezonans enerji transferi, FRET ile birlikte FLIM, rekombinant bir bakteri süspansiyonu ile başlar. Bakteriler, metabolik yollarda yer alan spesifik sitoplazmik proteinleri eksprese eder, FRET için uygun donör ve alıcı floresan proteinleri ile etiketlenmiştir.

Bakterileri bir mikroskop lamı üzerinde hareketsiz hale getiren bir agaroz ped üzerindeki bakteri süspansiyonunu tespit edin. Slaytın üzerine bir lamel yerleştirin ve kapatın.

Slaytı, FLIM-FRET mikroskobu için iki fotonlu uyarma ters çevrilmiş tarama mikroskobu üzerine yerleştirin. Bakteri tek tabakası üzerinde ilgilenilen bir bölgeyi seçmek ve taramak için bir floresan lamba kullanın.

İfade edilen sitoplazmik proteinler arasındaki etkileşim, verici ve alıcı floresan proteinleri uygun oryantasyonda yaklaştırır. Uygun bir dalga boyunda lazer aydınlatması üzerine, donör floresan proteini uyarılır.

Floresan proteinlerin yakınlığı FRET'i tetikleyerek, donörden alıcıya ışınımsal olmayan enerji transferine yol açan floresan proteinlerine yol açar, bu da uyarılır ve sonunda temel duruma geri dönere