$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Sinir sisteminde, transsellüler etkileşimler - spesifik sinaptik hücre adezyon molekülleri, transmembran proteinler, presinaptik ve postsinaptik nöronlar üzerindeki etkileşimler - sinapslarda trans-sinaptik sinyalleşmeye aracılık eden bir kompleks oluşturur.
Bir hücre agregasyon testi yoluyla insan embriyonik böbrek hücreleri üzerinde eksprese edilen sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki transcellite etkileşimleri tespit etmek için, transfekte edilmiş hücre süspansiyonları ile başlayın.
Bir transfekte hücre popülasyonu, istenen presinaptik hücre adezyon molekülünü ve yeşil floresan proteini ifade eder; diğeri spesifik postsinaptik hücre adezyon molekülünü ve kırmızı floresan proteini eksprese eder. Yeşil ve kırmızı floresan proteinleri ifade eden iki hücre popülasyonu da elde edilir.
Hücreleri santrifüjleyin. Hücreleri, kalsiyum iyonları ile takviye edilmiş uygun ortamda yeniden süspanse edin. Her iki popülasyonun transfekte edilmiş hücrelerini bir tüpte eşit olarak karıştırın. Diğer hücre popülasyonları için tekrarlayın.
İnkübasyon sırasında, kalsiyum iyonları, bir hücre popülasyonunda eksprese edilen presinaptik protein üzerindeki belirli bir bölgeye bağlanır. Bu, presinaptik proteinin diğer hücre popülasyonunun postsinaptik ligandı ile etkileşimini arttırır, bağlanmayı kolaylaştırır, bu hücreler arasındaki heterofilik hücre yapışmasına aracılık eder ve hücre agregasyonuna yol açar.
Bir floresan mikroskobu altında, hücrelerin yeşil ve kırmızı floresansını görselleştirerek uygun kanalları kullanarak hücreleri görüntüleyin. Görüntüleri işleyin.
Sadece floresan proteinleri ifade eden hücre popülasyonlarında herhangi bir agregasyon görülmez. Sinaptik hücre adezyon moleküllerini ifade eden yeşil ve kırmızı floresan hücreler arasındaki örtüşme nedeniyle hücre agregasyonu sarı olarak görselleştirilir ve bu da moleküller arasındaki hücre içi etkileşimleri düşündürür.
HEK293T hücreyi transfekte ettikten 48 saat sonra, hücreleri agregasyon için 6 oyuklu plakadan hasat edin. İlk olarak, her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe ayırmak için, her bir oyuğa 1 mililitre 10 milimolar EDTA ekleyin. Ardından, plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.
Beş dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve her bir kuyuyu ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe koyun. Tüpleri oda sıcaklığında 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
Hücreler peletlenirken, mikrosantrifüj tüplerinin üst kısımlarını deney koşullarıyla etiketleyerek altı inkübasyon tüpü hazırlayın. GFP ve mCherry'nin her permütasyonu kullanılmalıdır.
Süpernatanları 15 mililitrelik konik tüplerden çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak, her bir konik tüpteki hücreleri sayın. Daha sonra, her koşuldan 200.000 hücreyi, toplam 500 mikrolitre hacimde bire bir karışım için uygun inkübasyon tüpüne ayırın. İnkübasyon tüplerini oda sıcaklığında yavaş bir tüp döndürücüye yerleştirin.
Agregasyonu değerlendirmek için, başlangıçta ve 60 dakika sonra tekrar, inkübasyon tüpünden 40 mikrolitreyi yüklü bir mikroskop lamı üzerine pipetleyin. Temel edinim, hücrelerin mikrosantrifüj tüpüne eklenmesinden sonra mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
Slaytı hem yeşil hem de kırmızı kanallarda floresan altında görüntüleyin. Her slayt için, tek bir odak düzleminde üç farklı görüş alanının görüntülerini yakalayın.