Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:49 dk. • July 8th, 2025
Yakınlık ligasyon tahliline, disseke edilmiş nematodları alarak ve bunları germ hattı hücreleri açıkta kalacak şekilde bir slayt üzerine sabitleyerek başlayın. Bu hücreler, ortak proteinleri ile ilişkili RNA bağlayıcı proteinler, RBP'ler içeren yüksek seviyelerde ribonükleoprotein kompleksleri sergiler.
Slaytı, iki spesifik hedef proteini (RBP ve ortak proteini) tanıyan iki birincil antikorla kaplayın. Slaytı, ilgili birincil antikorlarına özgü iki tip ikincil antikor ile destekleyin.
Her ikincil antikor, tamamlayıcı dizilere sahip DNA zincirleri olan PLA probları ile konjuge edilir. İkincil antikorlar, önceden bağlanmış birincil antikorlara bağlanır ve iki PLA probunu yaklaştırır.
PLA probları ile hibridize olan konektör oligonükleotidleri içeren ligasyon tamponunu uygulayın ve ligaz enzimi boşluğu kapatarak dairesel DNA oluşturur. Slaytı, kırmızı bir florofora bağlı DNA polimeraz, dNTP'ler ve dedektör probları içeren bir amplifikasyon çözeltisi ile inkübe edin.
Polimeraz, dairesel DNA'yı bir şablon olarak kullanarak, birbirine bağlı şablon DNA'nın birçok kopyasını üreterek yuvarlanan bir daire amplifikasyonu başlatır. Amplifiye edilmiş DNA, PLA probuna bağlı kalır ve protein-prot
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin