Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Yakınlık ligasyon tahliline, disseke edilmiş nematodları alarak ve bunları germ hattı hücreleri açıkta kalacak şekilde bir slayt üzerine sabitleyerek başlayın. Bu hücreler, ortak proteinleri ile ilişkili RNA bağlayıcı proteinler, RBP'ler içeren yüksek seviyelerde ribonükleoprotein kompleksleri sergiler.

Slaytı, iki spesifik hedef proteini (RBP ve ortak proteini) tanıyan iki birincil antikorla kaplayın. Slaytı, ilgili birincil antikorlarına özgü iki tip ikincil antikor ile destekleyin.

Her ikincil antikor, tamamlayıcı dizilere sahip DNA zincirleri olan PLA probları ile konjuge edilir. İkincil antikorlar, önceden bağlanmış birincil antikorlara bağlanır ve iki PLA probunu yaklaştırır.

PLA probları ile hibridize olan konektör oligonükleotidleri içeren ligasyon tamponunu uygulayın ve ligaz enzimi boşluğu kapatarak dairesel DNA oluşturur. Slaytı, kırmızı bir florofora bağlı DNA polimeraz, dNTP'ler ve dedektör probları içeren bir amplifikasyon çözeltisi ile inkübe edin.

Polimeraz, dairesel DNA'yı bir şablon olarak kullanarak, birbirine bağlı şablon DNA'nın birçok kopyasını üreterek yuvarlanan bir daire amplifikasyonu başlatır. Amplifiye edilmiş DNA, PLA probuna bağlı kalır ve protein-protein etkileşimi lokalizasyonunu sağlar.

Kısa tek sarmallı oligonükleotidleri taşıyan dedektör probları, amplifiye edilmiş DNA'nın tamamlayıcı bölgeleri ile etkileşime girerek dupleksler oluşturur ve protein komplekslerine floresan sinyalleri verir. Slaytı bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin.

Hücre içinde başarılı protein-protein etkileşimlerini gösteren belirgin kırmızı lekeler olup olmadığını gözlemleyin.

Birincil antikorları seyreltmek için antikor seyrelticiyi kullanın. Slaytlar üzerinde 14 x 14 milimetre boşluk başına 40 mikrolitre seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi uygulayın. Slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Sabahları, slaytları bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında 50 mililitre 1x yıkama tamponu A ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Coplin kavanozunu 60 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın. Yıkama tamponunun slayttan akmasına izin vermek için slaytları bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve kenarlarını nazikçe silin.

Artı ve eksi problar içeren 40 mikrolitrelik bir çözelti hazırlayın. Çözeltiyi her 14 x 14 milimetrelik boşluğa ekleyin. Slaytları nemli bir odada 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. Slaytları bir Coplin kavanozunda oda sıcaklığında 50 mililitre 1x yıkama tamponu A ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.

Coplin kavanozunu 60 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın. Ligasyon tamponunu 1 ila 5 oranında ultra saf su ile seyreltin. Çalışan bir ligasyon çözeltisi stoğu hazırlamak için ligaz 1 ila 40 seyreltmek için bu tamponu kullanın. Yıkama tamponunun yanlardan akmasına izin vermek için sürgüyü bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve kenarlarını nazikçe silin.

Her 14 x 14 milimetrelik boşluğa 40 mikrolitre ligasyon solüsyonu ekleyin. Slaytları nemli bir odada 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Slaytları daha önce tarif edildiği gibi yıkadıktan ve kuruttuktan sonra, her 14 x 14 milimetrelik boşluğa ışıktan korunan 40 mikrolitre taze hazırlanmış amplifikasyon solüsyonu ekleyin.

Slaytları nemli karanlık odada 37 santigrat derecede 1 saat 40 dakika inkübe edin. Slaytları her biri 50 mililitre 1x yıkama tamponu B ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın ve slaytları 50 mililitre 0.01x yıkama tamponu B ile 1 dakika boyunca bir kez yıkayın.

Slaytın epoksi kaplı çevresini çizdikten sonra, her numuneye 10 mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve montaj ortamının yayılmasına izin verecek şekilde üstüne nazikçe bir lamel yerleştirin. Lameli kapatmak ve kaydırmak için lamel kenarını oje ile boyayın. Lameli hareket ettirmekten kaçının. Ojenin oda sıcaklığında ışıktan koruyarak en az 20 dakika sertleşmesine izin verin.