Etkileşim çalışmaları için birlikte immünopresipite edilmiş proteinleri hazırlamak için zar üzerinde protein sindirimi

Membran üzerinde sindirim gerçekleştirmek için, her biri ortak proteini ile ilişkili rekombinant GFP etiketli bir hedef protein içeren ko-immünopresipite protein komplekslerinden oluşan bir çözelti alın.

Proteinleri önceden ıslatılmış bir poliviniliden diflorür, PVDF membranı içeren bir tüpe aktarın ve inkübe edin. PVDF membranının hidrofilik yüzeyi, proteinlerin membran üzerine aktarılmasına yardımcı olur.

Protein içeren zarı yeni bir tüpe aktarın. Sistein kalıntıları arasındaki disülfür bağlarını azaltmak için indirgeyici ajan içeren bir tampon ekleyin, bu da komplekslerdeki tek tek proteinlerin etkileşimlerini bozmadan denatürasyonuna yol açar.

Bu çözeltiyi, komplekslerdeki her iki proteinin sülfhidril grubunu alkilleyen ve disülfür bağlarının yeniden oluşumunu önleyen bir alkilleyici reaktif ile değiştirin. Fazla reaktifi çıkarmak için zarı yıkayın.

Membrana, proteolitik bir enzim olan tripsin içeren bir tampon uygulayın. Tripsin, GFP etiketli hedef proteini ve ortak proteinini arginin ve lizin kalıntılarının karboksil terminalinde parçalayarak daha küçük peptitleri süpernatanın içine bırakır. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Membranı asidik bir çözelti ile yıkayın, bağlı pep