JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:57 dk. • July 8th, 2025
Membran üzerinde sindirim gerçekleştirmek için, her biri ortak proteini ile ilişkili rekombinant GFP etiketli bir hedef protein içeren ko-immünopresipite protein komplekslerinden oluşan bir çözelti alın.
Proteinleri önceden ıslatılmış bir poliviniliden diflorür, PVDF membranı içeren bir tüpe aktarın ve inkübe edin. PVDF membranının hidrofilik yüzeyi, proteinlerin membran üzerine aktarılmasına yardımcı olur.
Protein içeren zarı yeni bir tüpe aktarın. Sistein kalıntıları arasındaki disülfür bağlarını azaltmak için indirgeyici ajan içeren bir tampon ekleyin, bu da komplekslerdeki tek tek proteinlerin etkileşimlerini bozmadan denatürasyonuna yol açar.
Bu çözeltiyi, komplekslerdeki her iki proteinin sülfhidril grubunu alkilleyen ve disülfür bağlarının yeniden oluşumunu önleyen bir alkilleyici reaktif ile değiştirin. Fazla reaktifi çıkarmak için zarı yıkayın.
Membrana, proteolitik bir enzim olan tripsin içeren bir tampon uygulayın. Tripsin, GFP etiketli hedef proteini ve ortak proteinini arginin ve lizin kalıntılarının karboksil terminalinde parçalayarak daha küçük peptitleri süpernatanın içine bırakır. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
Membranı asidik bir çözelti ile yıkayın, bağlı peptitleri zardan ayırın ve tam ekstraksiyonu sağlayın. Peptit içeren fraksiyonları tek bir tüpe çekin. Vakumlu kurutma ile kurutun.
Kalıntıları düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse ederek, protein-protein etkileşimi tanımlaması için hazır olan peptitleri çözer.
Membranı hazırlamak için, kullanımdan hemen önce temizlenen cerrahi makas kullanarak PVDF membranları 3 milimetreye 3 milimetrelik parçalar halinde kesin. Membran parçalarını alüminyum folyo üzerine yerleştirin ve her parçaya 2 ila 5 mikrolitre etanol ekleyin. Membranlar tamamen kurumadan önce, her parçaya 2 ila 5 mikrolitre protein eluant ekleyin ve membran yüzeyi matlaşana kadar havayla kurutun.
Daha sonra, membranları 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve 4 santigrat derecede saklayın. Hemen kullanıyorsanız, 2 ila 30 mikrolitre etanol ekleyin, bu da onları hidrofilik hale getirecektir. Etanolü bir pipetle çıkarın. Ancak membranlar kurumadan önce, her tüpe tamamen 200 mikrolitre DTT bazlı reaksiyon çözeltisi ekleyin ve bunları bir saat boyunca 56 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, reaksiyon çözeltisini 300 mikrolitre iyodoasetamid çözeltisi ile değiştirin ve karanlıkta 45 dakika inkübe edin. Daha sonra membranları iki kez damıtılmış su ile ve bir kez %2 asetonitril ile en az 10 saniye girdaplayarak yıkayın.
Ditiyotreitol ve asetonitril ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Membran üstü sindirim prosedürü gerçekleştirilirken her zaman maske, gözlük ve eldiven giyilmelidir.
Tripsini el yazması talimatlara göre hazırlayın ve her zara 100 mikrolitre tripsin reaksiyon çözeltisi ekleyin. Sindirim için gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, reaksiyon çözeltisini 1.5 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın ve zara 100 mikrolitre yıkanmış çözelti ekleyin. Membranı iki saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra yıkanmış çözeltiyi toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Membrana 100 mikrolitre daha yıkanmış çözelti ekleyin ve 10 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra yıkanmış çözeltiyi toplayın ve reaksiyon çözeltisi ile karıştırın. Test tüpünü bir parça laboratuvar filmi ile örtün ve bir iğne ile filmde küçük delikler açın.
Çözeltiyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun ve kalıntıyı 10 mikrolitre% 0.2 formik asit içinde çözün. Tüpü üç dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir numune tüpüne aktarın.
Nano-LC HPLC sistemine bağlı bir kütle spektrometresi kullanarak numuneyi analiz edin.