Why does baseline measurement matter in BLI?

Establishing a stable baseline interferometric response before ligand loading ensures accurate detection of subsequent wavelength shifts during binding events, which is critical for reliable kinetic analysis and target validation decisions.

How does ligand immobilization affect analyte binding detection?

Immobilizing histidine-tagged ligands via Ni-NTA chemistry creates a stable binding surface, allowing analyte binding to be detected as increases in optical thickness and wavelength shift, enabling quantitative interaction measurement.

What does wavelength shift indicate during association and dissociation?

Wavelength shifts during association reflect ligand-analyte binding, while shifts during dissociation reveal complex stability; together, they provide kinetic data essential for assessing target engagement and lead quality.

Why are defined incubation times important in BLI workflows?

Using minimum durations (e.g., 30 seconds for baseline, 120 seconds for association/dissociation) ensures sufficient time for binding equilibrium and dissociation monitoring, improving data reproducibility and cross-team comparability.

What software capabilities are needed to analyze BLI data?

The associated software must record real-time interference patterns, calculate wavelength shifts over time, and generate sensorgrams for kinetic analysis (kon, koff, KD), enabling data-driven decisions in lead identification and target validation.

Ligand ve Analit Arasındaki Etkileşimleri Tespit Etmek için Biyokatman İnterferometri Teknolojisi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 5:13 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyokatman interferometrisi, BLI kullanarak ligand-analit etkileşimlerini tespit etmek için, istenen programa ayarlanmış, bir BLI cihaz yuvasına sabitlenmiş hidratlı bir fiber optik biyosensör ile başlayın.

Biyosensör ucu, nikel-nitrilotriasetik asit, Ni-NTA grupları ile hareketsiz hale getirilmiş biyouyumlu bir tabaka ile kaplanmıştır. Biyosensör ucunu tampona batırın.

Cihaz, iki arayüzden yansıyan biyosensöre doğru beyaz ışık yayar: dahili referans veya optik katman ve biyouyumlu katman. Yansıyan ışınlar, farklı ışık dalga boylarında yapıcı veya yıkıcı bir şekilde müdahale eder. Bir fotodetektör, ortaya çıkan girişim modelini algılar.

Temel interferometrik yanıt ölçümünü takiben, histidin etiketli bir ligand çözeltisi ekleyin. Histidin etiketleri, biyosensör üzerindeki nikel katyonlarına bağlanarak uçtaki ligandları hareketsiz hale getirir.

İlişkilendirmeyi takiben, yayılan beyaz ışık optik katmandan yansıtılır ve biyouyumlu katman, uçta artan optik kalınlığa sahip ligandlarla hareketsiz hale getirilir. Bu, yansıtıcı katmanlar arasındaki mesafeyi artırarak girişim deseni kaymasına ve dalga boyu kaymasına neden olur.

Bağlanmamış ligandları çıkararak ucu yıkayın. Hedef analit çözeltisi ile inkübe edin. Analit ligand'a bağlanarak uçtaki optik kalınlığı daha da artırarak dalga boyu kaymasının artmasına neden olur.

Biyosensör ucunu tampona yerleştirin. Uçta hareketsiz hale getirilmiş liganddan analit ayrışması sırasında dalga boyu kaymasını kaydedin.

Zaman içinde dalga boyu değişimindeki değişimin izlenmesi, ligandlar ve analitler arasındaki moleküler etkileşimlerin incelenmesini kolaylaştırır.

BLItz makinesini açın. Makinenin, makinenin arkasındaki bir USB veri çıkış bağlantı noktası aracılığıyla bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.

Bilgisayarda, ilgili yazılımı açın ve ekranın sol tarafındaki "Gelişmiş Kinetik" seçeneğine tıklayın. Yazılımda, deneyle ilgili tüm uygun bilgileri her bir başlığın altına yazın. "Biyosensör Tipi"ne tıklayın ve açılır menüden "Ni-NTA"yı seçin. Her adımın süresi gerektiği gibi Varsayılan'dan değiştirilebilir. En iyi sonuçlar için, Başlangıç Taban Çizgisi ve Taban Çizgisi için en az 30 saniye ve İlişkilendirme ve Ayrışma için 120 saniye kullanın.

Hidratlı Nikel-NTA-biyosensörü PCR tüpünden çıkarın ve biyosensörün geniş kısmını yuvanın üzerine kaydırarak makinedeki biyosensör yuvasına yapıştırın.

Makinenin tüp tutucusuna 0,5 mililitrelik siyah bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve içine 400 mikrolitre BLI tamponu pipetleyin. Makinenin kapağını, biyosensör ucu mikrosantrifüj tüpündeki tampona daldırılacak şekilde kapatın. İlk taban çizgisini kaydetmeye başlamak için yazılımda "İleri" ye tıklayın.

İlk temel adımın kaydı tamamlandıktan sonra, makinenin kapağını açın. Kaydırıcıyı sağa hareket ettirin. Damla tutucuya 4 mikrolitre diyalize edilmiş His etiketli ligandı pipetleyin ve yükleme adımını otomatik olarak kaydetmeye başlayacak olan makinenin kapağını kapatın.

Yükleme adımı kaydı tamamladıktan sonra makinenin kapağını açın. Kaydırıcıyı, tüp tutucu bir kez daha siyah okun önüne gelecek şekilde sola hareket ettirin. Makinenin kapağını kapatın ve biyosensör ucunun tüp tutucudaki tüpün BLI tamponuna daldırıldığından emin olun. Makine ve yazılım, temel adımı otomatik olarak kaydetmeye başlayacaktır.

Temel adım kaydı bitirdikten sonra, makinenin kapağını açın. Damla tutucuyu çıkarın ve herhangi bir proteini pipetleyerek ve çift deiyonize su ile toplam beş kez durulayarak temizleyin. Son yıkamadan sonra damla tutucunun yüzeyini temizlemek için bir mendil kullanın. Damla tutucuyu makineye geri takın. Makinedeki kaydırıcıyı, damla tutucu bir kez daha siyah okun önüne gelecek şekilde sağa doğru hareket ettirin.

Damla tutucuya 4 mikrolitre diyaliz analiti pipetleyin ve makinenin kapağını kapatın, bu işlem otomatik olarak ilişkilendirme adımını kaydetmeye başlayacaktır. İlişkilendirme adımının kaydı tamamlandıktan sonra, makinenin kapağını açın. Makinedeki kaydırıcıyı, tüp tutucu bir kez daha siyah okun önüne gelecek şekilde sağa hareket ettirin ve makinenin kapağını kapatın, bu işlem otomatik olarak ayrışma adımını kaydetmeye başlayacaktır.