Transfekte Edilmiş Hücrelerde Enzim Reseptör Etkileşimlerini İncelemek için İmmünopresipitasyon Testi

Programlanmış ölüm-1, bir hücre yüzeyi reseptör proteini olan PD-1, iki sitoplazmik tirozin motifi içerir - inhibitör motif, ITIM ve anahtar motifi, ITSM. Ligand bağlanması, ITIM ve ITSM fosforilasyonunu ve tirozin fosfataz proteini SHP2'nin PD-1'in sitoplazmik alanına alımını indükleyerek aşağı akış sinyal kaskadını tetikler.

Bir ko-immünopresipitasyon testi yoluyla SHP2-PD-1 etkileşimlerini incelemek için, yapışık bir epitel hücre kültürü elde edin. Bu hücreler yeşil floresan proteini, fosforile ITIM ve ITSM ile GFP etiketli vahşi tip PD-1'i eksprese eder. GFP etiketli mutant PD-1'i eksprese eden epitel hücreleri elde edin, burada ITIM veya ITSM mutasyonları fosforilasyonlarını inhibe eder.

Deterjan ve sodyum ortovanadat içeren lizis tamponu ekleyin. Deterjanlar hücreleri parçalayarak GFP etiketli PD-1 protein salınımına neden olur. Sodyum ortovanadat blokları fosfatazları serbest bıraktı, böylece ITIM ve ITSM defosforilasyonunu önledi.

Lizatı santrifüjleyin. Protein içeren süpernatanı taze tüplere aktarın. Anti-GFP antikor kaplı agaroz boncukları ekleyin. GFP etiketli PD-1 proteinleri, anti-GFP antikorlarına bağlanır.

SHP2 süspansiyonu ile inkübe edin. Boncuk bağlı PD-1-GFP, SHP2'yi fosforile ITIM ve ITSM yoluyla bağlar.

Laemmli tamponunu ekleyin ve kaynatın, böylece tampondaki indirgeyici maddeler ve deterjanlar PD-1-GFP-SHP2 protein komplekslerini denatüre eder. Denatüre protein komplekslerini içeren süpernatanı santrifüjleyin ve toplayın. SDS-PAGE ve western blot gerçekleştirin.

Vahşi tip ve ITIM mutasyona uğramış PD-1, SHP2 ile etkileşime girer. ITSM mutantları SHP2'yi bağlayamaz, bu da PD1-SHP2 etkileşiminin fosforile ITSM gerektirdiğini gösterir.

İmmünopresipitasyon yapılırken, tüm adımlar ya buz üzerinde ya da 4 santigrat derecede yapılmalıdır. İnhibitörlerin bir tabletini 10 mililitre tampon içinde çözerek lizis tamponunu proteaz inhibitörleri ile destekleyin. Ayrıca, PD1-GFP transfekte edilmiş plakalarda kullanılacak tampona 1 milimolar sodyum ortovanadat ekleyin. Hücrelere 500 mikrolitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, sodyum ortovanadat içeren lizis tamponunu sadece PD1-GFP transfekte edilmiş hücreler içeren plakalara eklediğinizden emin olun.

Hücreleri plakalardan hemen çıkarmak ve toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Lizatları 1.5 mililitrelik soğuk tüplere aktarın ve 30 dakika boyunca 0.005 kez g ve 4 santigrat derecede döndürün. Lizatlardan çekirdek sonrası süpernatantı toplamak için, onları 10 dakika boyunca 10.000 kez g ve 4 santigrat derecede döndürün.

Süpernatanları yeni tüplere aktarın ve peleti atın. Daha sonra WCL analizi için ikinci altı plaka seti için süpernatanları buz üzerinde saklayın.

Anti-GFP boncukları hazırlamaya başlamak için, çökelmeyi önlemek için boncukları içeren şişeyi açmadan önce hafifçe sallayın. Her koşul için 40 mikrolitre anti-GFP boncuklarını bulamaçtan çıkarın. 3 dakika boyunca 500 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Boncukları yıkamak için süpernatanı çıkarın, kaybı önlemek için pipet ile boncuklar arasındaki teması en aza indirdiğinizden emin olun.

Boncukları numune başına 80 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Yıkanmış boncukları doğrudan ilk dört plaka setinin PD1-GFP eksprese eden hücrelerinden hücre lizatına ekleyin. GFP etiketli proteinleri immünopresipite etmek için 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 0.005 kez g'de döndürün. Her yıkama için ortovanadat içermeyen 1 mililitre soğuk lizis tamponu kullanarak boncukları üç kez yıkayın. Ardından, 10 saniye boyunca 2.500 kez g'de santrifüjleyin.

Aktif SHP2'nin lizatını ilk plaka setinden üç eşit parçaya bölün ve yıkanmış PD1-GFP içeren boncukları içeren üç tüpün her birine bir porsiyon ekleyin. Transfekte edilmemiş hücrelerden lizat hacminin 1 / 3'ünü vahşi tip PD1-GFP boncuklarının ikinci tüpüne ekleyin. Kalan 2/3'ünü atın.

Boncukları 4 santigrat derecede 4 saat boyunca 0.005 kez g'de hafif rotasyonla inkübe edin. Bundan sonra, her yıkama için 1 mililitre soğuk lizis tamponu kullanarak boncukları iki kez yıkayın. Her numuneye 80 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve her tüpteki toplam hacmin 100 mikrolitre olduğundan emin olun. Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, her tüpten 50 mikrolitreyi iki yeni 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.

İlk olarak, boncukları 30 saniye boyunca 2.000 kez g ve 4 santigrat derecede döndürün ve süpernatanı çıkarın. 20 mikrolitre 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Bir BCA kiti kullanarak, giriş kontrollerinin protein konsantrasyonunu ölçün.

En seyreltilmiş numunenin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Giriş kontrollerinin geri kalanını en çok seyreltilmiş numune ile aynı konsantrasyonda seyreltmek için lizis tamponu kullanın. Ardından, seyreltilmiş giriş kontrollerinin her birinden 30 mikrolitreyi yeni bir tüpe aktarın. Lizatlara eşit hacimlerde 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın.

Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi Western blot analizini gerçekleştirmeden önce boncukları 30 saniye boyunca 2.000 kez g ve 4 santigrat derecede döndürün.