Transfekte Edilmiş Hücrelerde Enzim Reseptör Etkileşimlerini İncelemek için İmmünopresipitasyon Testi

Programlanmış ölüm-1, bir hücre yüzeyi reseptör proteini olan PD-1, iki sitoplazmik tirozin motifi içerir - inhibitör motif, ITIM ve anahtar motifi, ITSM. Ligand bağlanması, ITIM ve ITSM fosforilasyonunu ve tirozin fosfataz proteini SHP2'nin PD-1'in sitoplazmik alanına alımını indükleyerek aşağı akış sinyal kaskadını tetikler.

Bir ko-immünopresipitasyon testi yoluyla SHP2-PD-1 etkileşimlerini incelemek için, yapışık bir epitel hücre kültürü elde edin. Bu hücreler yeşil floresan proteini, fosforile ITIM ve ITSM ile GFP etiketli vahşi tip PD-1'i eksprese eder. GFP etiketli mutant PD-1'i eksprese eden epitel hücreleri elde edin, burada ITIM veya ITSM mutasyonları fosforilasyonlarını inhibe eder.

Deterjan ve sodyum ortovanadat içeren lizis tamponu ekleyin. Deterjanlar hücreleri parçalayarak GFP etiketli PD-1 protein salınımına neden olur. Sodyum ortovanadat blokları fosfatazları serbest bıraktı, böylece ITIM ve ITSM defosforilasyonunu önledi.

Lizatı santrifüjleyin. Protein içeren süpernatanı taze tüplere aktarın. Anti-GFP antikor kaplı agaroz boncukları ekleyin. GFP etiketli PD-1 proteinleri, anti-GFP antikorlarına bağlanır.

SHP2 süspansiyonu ile inkübe edin. Boncuk bağlı PD-1-GFP, SHP