JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 5:20 dk. • July 8th, 2025
Maya iki hibrit tahlili için, transkripsiyon aktivatör proteini GAL4'ten yoksun, genetik olarak tasarlanmış, aktif olarak büyüyen bir maya hücresi süspansiyonu alın. Bu hücreler lösin ve triptofan sentezleyemezler.
Bir çift ekspresyon plazmidi ekleyin: bir lösin kodlayan lösin ve GAL4'ün DNA bağlama alanı, DNA-BD, bir hedef protein alanına kaynaşmış ve diğer kodlayan triptofan ve GAL4'ün aktivatör alanı, AD, hedef proteinin başka bir alanına kaynaşmış.
Dönüştürme için uygun aracıları içeren bir arabellek ekleyin. Geçici gözenek oluşumuna neden olmak için hücrelere ısı şoku verin ve hücresel plazmit alımını kolaylaştırın. Gözenekleri yeniden kapatmak için soğutun. Hücreleri, lösin ve triptofan içermeyen seçici bir büyüme ortamı üzerine yerleştirin.
İki hibrit proteini eksprese eden dönüştürülmüş hücreler, lösin ve triptofan sentezler, hayatta kalır ve koloniler oluşturur.
Bir protein alanına kaynaşmış DNA-BD, β-galaktosidaz kodlayan gen promotör bölgesinin spesifik yukarı akış DNA dizisine bağlanır. Hedef protein alanları etkileşime girerse, AD ve DNA-BD yaklaşır ve fonksiyonel GAL4'ün yeniden yapılandırılmasına neden olur ve β-galaktosidaz geninin ekspresyonuna yol açar.
Kolonileri
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin